论文部分内容阅读
背景肥胖已经逐渐成为全球性的公共健康问题,例如美国肥胖发生率在儿童和青少年中为17.1%,在成人中约为32.2%。在中国,约有2100万超重儿童,其中50%诊断为肥胖[1]。肥胖和高血压、中风、2型糖尿病,冠心病及某些肿瘤的发生密切关键[2]。肥胖和骨质疏松关系密切,脂肪组织分泌的雌激素合成酶、瘦素、脂联素和多种促炎细胞因子对于骨重建具有重要作用[3]。骨质疏松作为一种系统性骨骼疾病,主要表现为骨量减少,骨组织微结构破坏,骨脆性增加及易骨折等。骨质疏松的常见临床并发症包括骨折,残疾以及慢性疼痛等[4]。有研究发现大部分骨质疏松患者表现为骨髓脂肪含量增加和骨质丢失[5]。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)作为成人干细胞的主要类型是成骨细胞和脂肪细胞共同的祖细胞来源,因此成骨分化和成脂肪分化之间存在着竞争性抑制[6]。同时,脂肪细胞对成骨细胞的功能和活性存在毒性作用[7]。Micro RNAs(mi RNAs)是近年来发现的一类内源性的单链非编码RNA(约含有18-24个核苷酸),它通过特异性结合于靶基因信使RNA(m RNA)的3’非编码区从而抑制转录后水平的翻译[8]。mi RNAs是机体的发育和生理过程的重要的调节因子,参与能量代谢,细胞分化,胰腺β细胞的发育,脂质代谢等[9,10]。其中,mi RNAs在间充质干细胞的分化过程发挥着重要的作用[11,12]。因此了解mi R-2861对于脂肪生成和MSCs的成脂肪分化的影响及可能的分子机制,可以为临床相关疾病如肥胖和骨质疏松症的预防和治疗提供依据和参考。目的(1)探究mi R-2861对MSCs和前脂肪细胞(3T3-L1)成脂分化的作用及其机制。(2)探究MSCs和成骨细胞或脂肪细胞共培养条件下,mi R-2861对其成脂分化和成骨分化的作用。方法(1)采用高脂饮食和正常饮食喂养的方式分别建立肥胖小鼠模型和正常对照小鼠并通过小鼠体重测量、BMI计算和脂肪组织称重,脂肪组织HE染色及RT-q PCR检测成脂标志基因等进行验证。采用RT-q PCR技术检测mi R-2861在肥胖小鼠和正常小鼠肾周脂肪和腹股沟脂肪组织中的表达差异;采用RT-q PCR技术检测mi R-2861在MSCs和C3H10T1/2细胞成脂分化及3T3-L1脂肪形成过程中的表达变化。(2)采用Ⅱ型胶原酶消化的方法从小鼠股骨的密质骨分离并采用5%氧浓度的低氧环境培养MSCs;流式细胞学技术检测细胞表面分子标记;细胞形态学观察、茜素红染色、油红O染色和RT-q PCR检测成骨和成脂标志基因的表达;采用Ⅰ型胶原酶和胰酶连续消化法从出生72小时之内的乳鼠颅骨中分离并培养原代成骨细胞(OB)。(3)采用细胞转染技术过表达mi R-2861或者抑制表达mi R-2861,通过油红O染色、脂肪细胞计数、RT-q PCR和Western blot技术检测mi R-2861转染后对MSCs和C3H10T1/2细胞成脂分化和3T3-L1细胞脂肪形成的影响。(4)结合信息学软件预测、双荧光素酶报告实验检测及Western blot实验确定mi R-2861的靶基因。(5)通过3T3-L1细胞转染小干扰si-RNA-SIRT1下调SIRT1的m RNA和蛋白的表达以及给予SIRT1的激活剂CAY10602处理之后,对脂肪细胞进行油红O染色、RT-q PCR检测成脂标志基因的表达来确定SIRT1对成脂分化的作用;同时转染mi R-2861 mimic和si-SIRT1或者同时转染mi R-2861 inhibitor和si-SIRT1以及同时给予mi R-2861 mimic转染和CAY10602处理后,脂肪细胞油红O染色、脂肪细胞计数、RT-q PCR和Western blot检测成脂标志基因和蛋白的表达以检测mi R-2861是否通过靶向SIRT1调节成脂分化。(6)采用免疫荧光和Western blot检测mi R-2861过表达和抑制表达之后,细胞核β-catenin的表达情况;同时抑制mi R-2861表达和沉默SIRT1后,Western blot检测细胞核β-catenin蛋白的表达情况。(7)应用Transwell小室在MSCs与OBs以间接接触的方式进行共培养的条件下,同时给予mi R-2861转染和成脂诱导或成骨诱导,RT-q PCR和Western blot方法检测成脂标志基因(a P2、C/EBPα、PPARγ)和蛋白及成骨标志基因(ALP、OCN、RUNX2)的表达情况。将3T3-L1细胞诱导成为脂肪细胞后,使用Transwell小室与MSCs共培养,同时将MSCs转染mi R-2861和成骨诱导分化,通过给予茜素红染色观察矿化结节形成情况,RT-q PCR技术检测成骨标志基因(ALP、OCN、RUNX2)的表达情况。实验结果(1)高脂饮食组小鼠体重和BMI较正常组小鼠体重增加20%以上,符合肥胖标准;高脂饮食组小鼠肾周脂肪组织和腹股沟脂肪组织重量显著高于正常饮食组;高脂饮食组小鼠肾周脂肪组织和腹股沟脂肪组织的HE染色显示单个脂肪细胞体积明显高于正常饮食组小鼠;RT-q PCR结果显示成脂标志基因adiponectin、a P2、C/EBPα、PPARγ的表达在高脂饮食小鼠脂肪组织中表达显著高于正常饮食小鼠的脂肪组织;RT-q PCR结果显示mi R-2861在高脂饮食组小鼠的肾周脂肪和腹股沟脂肪组织中的表达明显高于正常饮食小鼠肾周脂肪和腹股沟脂肪;mi R-2861表达在3T3-L1成脂过程中较未诱导组明显升高,在第四天时达到最高,而后有所下降,但仍高于未诱导组;mi R-2861在MSCs和C3H10T1/2细胞成脂分化过程中显著上升,而在成骨分化过程中显著下降。(2)密质骨分离和低氧培养得到的MSCs为成纺锤形;流式细胞技术检测结果显示间充质干细胞表面分子标记CD44(80%)、CD29(90.5%)阳性,造血细胞表面分子标记CD45(0.5%)阴性;在MSCs给予成骨诱导之后,茜素红染色呈阳性,同时RT-q PCR结果显示成骨标志基因(ALP、OCN、RUNX2)表达明显升高;在MSCs给予成脂诱导之后,油红O染色呈阳性,同时RT-q PCR结果显示成脂标志基因(adiponectin、PPARγ、a P2、C/EBPα)表达显著上调。(3)mi R-2861过表达之后,油红O染色、脂肪细胞计数、RT-q PCR和Western blot检测成脂标志基因和蛋白(adiponectin、a P2、C/EBPα、PPARγ)均表明MSCs和C3H10T1/2细胞成脂分化显著增加;反之,抑制mi R-2861表达后,MSCs和C3H10T1/2细胞成脂分化受到显著抑制;mi R-2861过表达后,油红O染色、脂肪细胞计数、RT-q PCR和Western blot技术检测成脂标志基因和蛋白(adiponectin、a P2、C/EBPα、PPARγ)均显示3T3-L1脂肪细胞生成显著增加;反之,抑制mi R-2861表达后,3T3-L1脂肪细胞生成明显受到抑制。(4)双荧光素酶报告实验和Western blot检测结果均表明,SIRT1为mi R-2861的直接靶基因。(5)MSCs和3T3-L1分别转染si-SIRT1后,SIRT1蛋白表达下降;下调SIRT1后油红O染色、脂肪细胞计数明显减少;RT-q PCR检测结果显示下调SIRT1后,成脂标志基因a P2、C/EBPα、PPARγ的表达明显升高;3T3-L1细胞给予SIRT1激活剂CAY10602后,成脂标志基因a P2、C/EBPα、PPARγ表达明显下降,这些均表明SIRT1抑制成脂分化;同时转染mi R-2861 mimic和si-SIRT1并给与成脂诱导之后较mi R-2861 mimic negative control和si-SIRT1共同转染组,油红O染色和成脂标志基因表达明显增加,同时转染mi R-2861 mimic和CAY10602处理之后给予成脂诱导,结果显示较mi R-2861 mimic组,成脂标志基因的表达明显降低;同时转染mi R-2861 inhibitor和si-SIRT1并给与成脂诱导之后较mi R-2861inhibitor negative control和si-SIRT1共转染组,油红O染色和成脂标志基因的表达显著下降。(6)免疫荧光和Western blot结果显示转染mi R-2861 mimic后,细胞核β-catenin表达较mimic negative control组表达下降;反之,转染mi R-2861 inhibitor后,细胞核β-catenin表达较inhibitor negative control组表达升高;转染si-SIRT1后,细胞核β-catenin表达较negative control组下降;同时转染mi R-2861 inhibitor和si-SIRT1组较同时转染mi R-2861 inhibitor和si-negative control组细胞核β-catenin的表达降低。(7)MSCs和OBs共培养4d,MSCs成脂分化降低;MSCs和OBs共培养并同时给予mi R-2861转染4d,mi R-2861mimic增加adiponectin、a P2、PPARγ、C/EBPα的m RNA表达,mi R-2861inhibitor降低PPARγ的表达。MSCs和OBs共培养8d,MSCs成脂分化增加;MSCs和OBs共培养并同时给予mi R-2861转染8d,mi R-2861mimic增加adiponectin、a P2、PPARγ、C/EBPα的m RNA表达;mi R-2861inhibitor抑制a P2、PPARγ、C/EBPα的m RNA表达。Western blot结果和RT-q PCR检测相一致,mi R-2861mimic促进a P2和C/EBPα蛋白的表达,相反的,mi R-2861inhibitor抑制a P2和C/EBPα蛋白的表达;MSCs和OBs共培养条件给予成骨诱导和mi R-2861转染8d,mi R-2861 mimic显著降低OCN、Osterix的m RNA表达,相反的,mi R-2861 inhibitor显著增加ALP、OCN、Runx2和Osterix的m RNA表达;MSCs和脂肪细胞(adipocytes)共培养条件给予成骨诱导和mi R-2861转染8d,mi R-2861 mimic显著降低ALP、OCN、Runx2、Osterix的m RNA表达,相反的,mi R-2861 inhibitor显著增加ALP和Runx2的m RNA表达。茜素红染色结果显示,mi R-2861 mimic组矿化结节形成较NC-mimic组明显减少;mi R-2861 inhibitor组矿化结节形成明显多于NC-inhibitor组。结论(1)mi R-2861靶向SIRT1通过Wnt/β-catenin信号通路促进成脂分化。(2)MSs S和OB共培养条件下,mi R-2861促进其成脂分化而抑制其成骨分化;MSCs和脂肪细胞共培养条件下,mi R-2861抑制其成骨分化。