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本研究目的是构建永生化的水牛乳腺上皮细胞体外培养体系,为今后研究水牛乳腺组织发育和泌乳生理功能调控机理奠定基础。实验以泌乳期沼泽型水牛的乳腺组织为材料,进行了如下研究:实验一,探讨了水牛乳腺上皮细胞分离、纯化培养方法及细胞的特性。选取处于泌乳期沼泽型水牛的乳腺组织分别采用组织块接种法和酶消化法分离培养原代水牛乳腺上皮细胞。利用乳腺上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感性不同和细胞贴壁时间差进行分离纯化,获得纯乳腺上皮细胞。形态观察发现纯化后乳腺上皮细胞呈鹅卵石状,具有典型上皮细胞的形态特征;染色体核型分析表明,染色体数目48(2n)条,与沼泽型水牛染色体数目相符;荧光免疫细胞染色法表明,培养的乳腺上皮细胞具有角蛋白-8的特异性表达,且在雌二醇激素的诱导下能表达出a-酪蛋白。实验二,探讨了水牛乳腺上皮细胞永生化的方法。利用实验一所获得的水牛乳腺上皮细胞系,采用DNA—磷酸钙沉淀转染法,将SV40质粒转染纯化后第4代的水牛乳腺上皮细胞,经过筛选后继续培养,细胞的轮廓变大,但生长速度无明显改变(差异不显著,P＞0.05),到目前为止细胞总共已传了15代,细胞生长状况良好。经过端粒重复序列扩增(TRAP)—银染法检测转染前后细胞的端粒酶活性,结果表明转染后细胞的端粒酶活性要比未转染前的高。实验三,探讨了雌激素受体α、催乳素受体在永生化水牛乳腺上皮细胞中的表达情况和不同浓度雌二醇对水牛乳腺上皮细胞增殖的影响。根据NCBI上发表的奶牛雌激素受体α基因和催乳素受体基因cDNA序列,设计两对特异性引物,用RT-PCR从永生化水牛乳腺上皮细胞系扩增水牛雌激素受体α基因和催乳素受体基因部分序列。结果扩增出雌激素受体α基因序列为171bp,催乳素受体基因序列为253bp,与奶牛的同源性分别为100%和99.2%。证实了永生化水牛乳腺上皮细胞与原代细胞一样,仍能表达雌激素受体和催乳素受体。采用MTT法检测不同浓度雌二醇对水牛乳腺上皮细胞增殖的影响,结果得到浓度为5mg/L处理组的增殖效果最佳,差异显著(P＜0.05)。以上结果表明:(1)用组织块接种法比酶消化法更易获得原代的水牛乳腺上皮细胞;(2)经过荧光免疫细胞染色、α-酪蛋白PCR鉴定和染色体核型分析证实所获得的细胞为水牛乳腺上皮细胞,且具有正常分泌酪蛋白的功能;(3)通过DNA-磷酸钙沉淀法转染使SV40在水牛乳腺上皮细胞中得到表达,细胞的端粒酶活性高于未转染前,成功建立了永生化沼泽型水牛乳腺上皮细胞体外培养体系;(4)经过SV40转染后水牛乳腺上皮细胞仍表达雌激素受体α和催乳素受体;(5)适当浓度的雌二醇可以促进水牛乳腺上皮细胞的增殖,而高浓度的雌二醇则会抑制水牛乳腺上皮细胞增殖,以浓度为5mg/L时细胞的增殖效果最佳。