模式链霉菌DNA甲基化研究

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5-甲基胞嘧啶是DNA甲基化修饰众多类型中的一种,大肠杆菌Escherichia coli K12编码的Dcm可以对5’CCWGG3’(W=A/T)中的第二个C进行甲基化。Dcm甲基转移酶自发现至今已经有37年了,其功能尚未确定。它被怀疑与 II型限制修饰系统有关,另有研究结果显示,Dcm甲基化能影响原核生物中核糖体的表达水平及次级代谢产物的合成。  天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌这两个模式菌株基因组DNA序列一致性高达99%以上,但是,前者对甲基化DNA有很强的限制作用,后者对来自大肠杆菌的任何DNA几乎都没有限制性。这两个模式菌株的基因组自身的甲基化基因型到现在没有报导。本研究首次通过HPLC-MS在天蓝色链霉菌中检测到了甲基化胞嘧啶(dmC)及6-甲氨基嘌呤(d6mA),而对外源DNA无限制性的变铅青链霉菌没有检测到这两种修饰。基于Rebase(http://tools.neb.com/~vincze/genomes/view.php?view_id=214),我们在变铅青链霉菌中表达了所有的6个DNA甲基转移酶基因:sco3104、sco3510、sco5331、sco6627、sco6844、sco6885,并将其构建到整合型链霉菌表达载体pIB139上,通过接合转移的方式导入变铅青链霉菌中。LC-MS/MS分析这几个表达菌株的基因组DNA发现:sco6627负责天蓝色链霉菌中dmC的合成,sco6885负责d6mA的合成。由于天蓝色链霉菌含有多重甲基化修饰依耐型的限制系统,而被认为可能不含有任何甲基化修饰;变铅青链霉菌是异源表达的通用宿主,对甲基化的DNA几乎没有限制性,而被认为含有和大肠杆菌类似的限制系统。我们的实验结果和传统的假设很明显是相反的,这意味着天蓝色链霉菌中的限制和修饰存在很复杂的调控机制。  天蓝色链霉菌与变铅青链霉菌在次生代谢产物方面有明显差异,基于这两个模式菌株在甲基化修饰上的不同,我们怀疑是不是甲基化的表观修饰在其中起到了作用;另外,考虑到dcm基因的功能仍然不清,而变铅青链霉菌具有复杂的生理和形态分化,是观察表观修饰的良好材料,故我们人为的将dcm基因导入变铅青链霉菌中考察其功能。当dcm基因通过整合型表达载体pPM927导入变铅青链霉菌HXY16(硫修饰基因组岛缺失)后,出现了大小不一的接合转移子,而仅含有pPM927载体空白对照中菌落形体一致;分别收大菌落及小菌落的孢子进一步培养,发现大菌落的后代形态保持一致,而小菌落中则以5%的频率出现大菌落。经过甲基化敏感酶切验证,发现dcm基因仅在小菌落中表达;Southern杂交实验表明,大菌落中dcm基因没有表达的原因是该基因及载体部分片段缺失。另外,衍生于变铅青链霉菌的小菌落在MS培养基中有明显的蓝色色素(放线紫红素)积累,在R5液体培养基中有紫红色色素积累,大菌落在以上两种培养基上均未观察到该现象;这说明dcm基因的表达激活了变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素基因簇的表达。综上所述,dcm基因不仅可影响变铅青链霉菌的菌落形态,使其变小,同时也能激活放线紫红素的表达。
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