背景:抑郁症是临床常见的精神障碍性疾病,严重威胁人类身心健康。许多研究表明成年期抑郁等精神障碍性疾病的发生与生命早期不良社会经历如生命早期母婴分离、被虐待、被忽视等有关。随着社会的快速发展,社会竞争压力的加大,越来越多的人迫于生活的压力,奔波于外地甚至是国外,导致其家庭结构发生变化,其子代在出生早期或童年期与父母双方或一方尤其是母亲处于分离状态。流行病学调查发现生命早期母婴分离的儿童在成年后患抑郁等精神疾病的风险增高。生命早期的母婴分离是一种严重的应激,影响机体神经系统等的正常发育,导致机体成年后出现抑郁症等精神障碍性疾病。目前临床常用的抗抑郁药等治疗精神疾病的药物多存在毒副作用及耐药性等缺点,而针灸治疗抑郁等精神障碍性疾病取得较好疗效,且毒副作用少,但是针灸能否治疗由于生命早期母婴分离诱导的神经发育障碍导致的抑郁症,其治病的机理是什么尚不清楚。目的:1.通过建立生命早期母婴分离大鼠模型以模拟人类生命早期母婴分离的现象,观察生命早期母婴分离对大鼠成年后的行为学及认知功能的影响;2.采用电针百会和印堂穴进行干预,观察电针对生命早期母婴分离成年大鼠行为学及认知功能影响,探索电针对生命早期母婴分离诱导的成年大鼠抑郁样症状的治疗作用及其治病机制。3.采用新一代高通量转录组测序技术,在转录组水平获相关差异基因表达,探索电针改善生命早期母婴分离导致的成年大鼠抑郁症样症状可能的作用机制,阐明电针脑保护作用机理,以期为临床电针治疗生命早期母婴分离应激导致的成年期抑郁症提供实验依据。方法:母婴分离大鼠模型制备:新生子代大鼠在PND1-20期间,每天进行4小时母婴分离,即每天9:00-13:00期间将子代大鼠的母鼠转移到另一个新的鼠笼内,4小时后再返回原子代大鼠鼠笼内,连续进行20天。在PND1-10期间,为维持子代大鼠的体温,将子代大鼠放在恒温垫上以维持子代大鼠体温。PND11-21,子代大鼠正常饲养于鼠笼内。分离期间所有大鼠均自由饮食。空白对照组子代大鼠正常饲养,除在PND10更换鼠笼内垫料外,不予任何刺激。所有大鼠在PND21断奶。大鼠断奶后按每笼同性别4-5只饲养,自由饮食,直至PND60。在PND60,将除去雌性大鼠,雄性大鼠用于实验。分组:将参与母婴分离的子代大鼠随机分为MS组、MS+EA组、MS+Sham-EA组和MS+Flu组。Control组大鼠为正常成长的子代雄性大鼠（未进行母婴分离）的子代大鼠。每组11只。为减少不同窝大鼠造成的差异,每组大鼠均来自不同的4只母鼠生产的子代大鼠。干预方法:MS+EA组:采用韩式电针仪电针百会穴和印堂穴,电流为2 m A,频率为2 HZ,电针时间为20 min,隔日1次,一共治疗21天;MS+Sham-EA组:将针灸针用胶带贴到百会穴和印堂穴位表面,针不刺入皮肤,连接韩式电针仪,但不予通电。假电针组干预时间为20min,隔日1次,一共治疗21天;MS+Flu组:予腹腔注射氟西汀（10mg/kg）,隔日1次,一共治疗21天;Contro组:予注射等体积的0.9%Na Cl,隔日1次,一共治疗21天。各组大鼠干预期间在异氟烷麻醉状态下进行,麻醉时间均为20 min。检测:（1）每周一次监测大鼠体质量的改变（从大鼠断奶后至电针治疗结束期间）,采用行为学（糖水偏爱测试、强迫游泳测试、十字高架测试及前脉冲抑制测试）评价动物模型,并采用放射免疫法测定大鼠血浆中CORT和ACTH的水平以观察各组大鼠神经内分泌改变;（2）采用Morris水迷宫、条件恐惧测试进行观察电针对生命早期母婴分离的成年大鼠认知功能的作用,并采用在体电生理技术记录海马SC-CA1区突触LTP的变化;（3）采用新一代高通量转录组测序技术,对Contro组、MS组和MS+EA组前额叶皮质脑区进行高通量测序研究,在转录组水平获取三组差异表达基因,结合生物信息学技术,进行差异表达基因GO、KEGG和趋势分析,探索电针改善生命早期母婴分离导致的成年大鼠抑郁症样症状的差异基因表达参与的可能作用机制。结果:1.实验结果一:（1）各组实验大鼠从断奶当天（PND21）开始,每周测量一次大鼠的体质量发现各组大鼠体质量在出生后3-11周体重差异无统计学意义（P>0.05）,提示新生期反复的母婴分离及电针对大鼠营养和生长均无显著影响。（2）生命早期母婴分离导致大鼠成年期表现出快感缺失和绝望行为,母婴分离的成年大鼠表现为对糖水偏爱度降低（P<0.01）,在强迫游泳测试中不动时间延长（P<0.01）;经电针百会和印堂治疗3周后,与MS组相比,MS+EA组大鼠糖水消耗量增加（P<0.01）,在强迫游泳测试中不动时间减少（P<0.05）;MS+Sham-EA组大鼠糖水消耗量和在水迷宫测试中不动时间未明显改善（P>0.05,P>0.05）。（3）在高架测试中,与Control组相比,生命早期母婴分离成年大鼠在开放臂的停留的时间有所减少,但差异无统计学意义（P>0.05）;成年后经电针干预21天,与MS组相比,MS+EA大鼠在开放臂的时间有增加趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;各组大鼠在前脉冲抑制实验测试中并未表现明显差异（P>0.05）。提示本研究中生命早期PND1-20母婴分离的大鼠未诱导出成年大鼠明显的焦虑和精神分裂样症状。（4）采用放射免疫法检测实验大鼠血浆中CORT和ACTH的含量发现,生命早期母婴分离导致大鼠成年期血浆CORT和ACTH的含量均明显升高（P<0.05,P<0.05）,提示生命早期母婴分离应激导致HPA轴功能亢进。成年早期经电针治疗21天后,与MS组相比,MS+EA组大鼠血浆中CORT和ACTH的含量均明显降低（P<0.05,P<0.01）;而MS+Sham-EA组大鼠血浆中CORT和ACTH的含量未明显改善（P>0.05,P>0.05）。说明电针百会和印堂可抑制生命早期母婴分离引起的HPA轴功能亢进。总之,本研究结果显示出生后PND1-20每天4小时的母婴分离可引起大鼠成年后抑郁样行为表现,电针百会和印堂可改善生命早期母婴分离导致的抑郁样症状。2.实验结果二:（1）电针改善生命早期母婴分离导致的成年大鼠空间学习和记忆能力障碍。Morris水迷宫测试:Control组大鼠在Morris水迷宫测试训练期潜伏期时间逐渐的减少。Control组相比,MS组和MS+Sham-EA组的潜伏期增加（P<0.01,P<0.05,resp）,提示生命早期母婴分离导致成年大鼠空间学习和记忆功能障碍。与MS组相比,MS+EA组大鼠潜伏期明显减少（P<0.01）。与Control组大鼠相比,MS组和MS+Sham-EA组大鼠在目标象限时间的百分数明显降低（P<0.05,P<0.05）;与MS组大鼠相比,MS+EA和MS+Flu组大鼠在目标象限时间的百分数明显增加（P<0.05,P<0.05）。MS+EA和MS+Flu组大鼠在目标象限时间的百分数与空白组大鼠在目标象限时间的百分数差异无统计学意义（P>0.05,P>0.05）。（2）电针改善母婴分离导致的成年期大鼠海马依赖的认知功能障碍。条件恐惧记忆测试:为了进一步验证电针对母婴分离导致的成年后大鼠海马依赖的认知功能的改善作用,本研究将实验大鼠还进行了条件恐惧测试。场景性恐惧记忆测试（context dependent memory）:与Control组相比,MS组和MS+Sham-EA组僵立时间（freezing）明显降低（P<0.01,P<0.05）,而MS+EA组和MS+Flu组大鼠僵立时间差异无统计学意义（P>0.01,P>0.05）;与MS组相比,MS+EA组大鼠僵立时间明显增加（P<0.05）,而MS+Sham-EA组僵立时间差异无统计学意义（P>0.05）。声音依赖的恐惧记忆测试（tone dependent memory）:各组大鼠在声音依赖的条件恐惧记忆测试中的僵立时间差异无统计学意义（P>0.05）。这一结果提示电针可改善生命早期母婴分离导致成年大鼠场景性条件恐惧记忆障碍。由于场景性恐惧记忆的形成主要依赖于海马,而声音依赖的恐惧记忆的形成主要依赖于杏仁核,结合Morris水迷宫测试结果提示生命早期母婴分离损伤了成年大鼠海马依赖的认知功能,电针可以改善生命早期母婴分离导致的成年大鼠海马依赖的认知功能障碍。（3）体电生理记录结果:为了更直接评估电针对生命早期母婴分离导致的成年大鼠海马神经可塑性相关的认知功能障碍的影响,探究其可能的作用机制,本研究采用体电生理记录,记录HFS诱导的各组大鼠海马SC-CA1区突触LTP改变。与Control组相比,MS组和MS+Sham-EA组大鼠海马区f EPSPs平均变化斜率明显降低（P<0.05,P<0.05）,而MS+EA组大鼠f EPSPs平均变化斜率无明显差异（P>0.05）。与MS组相比,MS+EA组f EPSPs平均变化斜率明显增加（P<0.01）,而MS+Sham-EA组和MS+Flu组大鼠f EPSPs平均变化斜率差异无统计学意义（P<0.05）。3.实验结果三:差异基因分析结果显示:Control组vs MS组、MS组vs MS+EA组和Control组vs MS+EA组三个比较组合共253个差异表达基因,共同的差异表达基因24个。Control组vs MS组和MS组vs MS+EA组共有的差异表达基因有4个,分别为complexin 3、ras-related protein Rab-1B-like、synaptotagmin VI和uncoupling protein 3。GO分析:MS与Control组之间差异基因涉及的生物过程（BP）主要包括前列腺上皮细胞形态的发生过程,脂肪酸代谢过程,活化的T细胞增殖的正调控作用,蛋白异寡聚化过程,女性怀孕过程、运输过程等;涉及的分子功能主要包括突触结合蛋白活性,丁酸辅酶A连接酶活性,SNARE结合氧离子跨膜转运活性等;生物功能涉及的细胞成份上主要有线粒体膜,线粒体基质,线粒体等。这些生物信息提示了生命早期母婴分离造成的抑郁症状可能与这些相关生物功能有关,有可能是其治疗的作用靶点。MS+EA与MS组之间,差异基因涉及的生物过程主要包括调节肾钠排泄过程,对类固醇激素的反应过程,正常调节肾钠盐排泄,饮酒行为等;涉及的分子功能主要包括ɑ1-肾上腺素能受体活性,钙依赖性磷脂结合,2型血管紧张素受体结合,烷基硫酸酯酶活性,催产素受体结合,序列特异性DNA结合转录因子募集转录因子活性,突出融合蛋白结合,乙酰转移酶活化剂活性等;生物功能涉及线粒体膜,线粒体基质,线粒体,信号肽酶复合物等。MS+EA与MS组差异基因涉及的生物过程主要包括调节肾钠排泄过程,对类固醇激素的反应过程,正常调节肾钠盐排泄,饮酒行为等;涉及的分子功能主要包括ɑ1-肾上腺素能受体活性,钙依赖性磷脂结合,2型血管紧张素受体结合,烷基硫酸酯酶活性,催产素受体结合,序列特异性DNA结合转录因子募集转录因子活性,突出融合蛋白结合,乙酰转移酶活化剂活性等;生物功能涉及线粒体膜,线粒体基质,线粒体,信号肽酶复合物等。趋势分析（Series Cluster）:与Control组相比,MS组差异基因下调,经电针干预后（MS+EA）差异基因表达上调的差异基因涉及的生物过程为:四肢关节形态形成、食道平滑肌收缩、顶体囊泡胞吐、硫酸乙酰肝素蛋白多糖的代谢过程、前列腺芽形成的负调节、胶质细胞衍生的神经营养因子受体信号通路、药物输出、成纤维细胞生长因子受体信号通路的调节、胚胎过程涉及女性怀孕、肾小球基底膜发育、负调控成纤维细胞生长因子受体信号通路、尿酸代谢过程、毒品运输、肾小球滤过、支配、顶体反应、软骨细胞发育、硫化合物代谢过程、对叶酸的反应、血管内皮生长因子受体信号通路;涉及的分子功能为:syntaxin结合、烷基硫酸酯酶活性、神经递质转运蛋白活性、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶活性、芳基硫酸酯酶活性、异生物转运ATP酶活性、硫酸酯水解酶活性、药物跨膜转运蛋白活性、网格蛋白结合、圈套绑定、ATP酶活性,加上物质的跨膜运动、钙依赖性磷脂结合、钙离子结合、钙依赖性蛋白质结合、蛋白质同源二聚化活性、核苷三磷酸酶活性、ATP酶活性;涉及的细胞成份为:核周内质网、突触、高尔基体、细胞连接处、膜的外在成分、突触小泡膜、质膜、突触小泡、线粒体膜。与Control组相比,MS组差异基因上调,经电针干预后（MS+EA）差异基因表达下调的差异基因涉及的生物过程为::调节肾钠排泄、哺乳期、细胞钠离子稳态、饮酒行为、女性怀孕、血管收缩、调节血管的大小、ERK1和ERK2级联、正相调节血压、脂肪酸代谢过程、多细胞生物体生长的正调控、对寒冷的反应、细胞对激素刺激的反应、肥大细胞分化的正调控、子宫平滑肌收缩、正面调节后肠收缩、组织重塑的负调控、对类固醇激素的反应、活性反应;涉及的分子功能:2型血管紧张素受体结合、催产素受体结合、乙酰转移酶活化剂活性、5-氨基乙酰丙酸合酶活性、补体成分C1q结合、V1B加压素受体结合、脂肪酸连接酶活性、神经垂体激素活性、V1A加压素受体结合、氧化磷酸化解偶联剂活性、ɑ1-肾上腺素能受体活性、1-磷脂酰肌醇-5-磷酸4-激酶活性、血管紧张素受体结合、激素活性、丁酸-Co A连接酶活性、1-磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶活性、血红蛋白ɑ结合、血红蛋白β结合、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性、1型血管紧张素受体结合;涉及的细胞成份:膜攻击复合物、线粒体基质、触珠蛋白-血红蛋白复合物、血红蛋白复合物、线粒体内膜。KEGG分析结果显示:MS组与Control比较在KEGG中富集的通路有5条:丁酸代谢,生物素代谢,p53信号通路,胆汁分泌,Fox O信号通路。而MS VS MS+EA在KEGG中富集的通路主要有3条:酒精成瘾、病毒癌变和肾素-血管紧张素系统。由于本次测序结果筛选出的差异基因较少,信息较为孤立懒散,因此相较于GO富集分析,KEGG信号通路富集分析的结果可参考价值较低,因为真正参与到信号通路的并且表达具有差异的基因其实很少,以此说明富集到的通路就介导了机体功能紊乱的发生或电针发挥治疗作用可能是不客观的。结论:（1）生命早期母婴分离可导致成年大鼠抑郁样行为表现,电针百会和印堂穴可改善生命早期母婴分离诱导的成年大鼠抑郁样行为、抑制其HPA轴功能亢进,提示电针改善生命早期母婴分离诱导的成年大鼠抑郁样行为可能与电针调节HPA轴功能有关。（2）生命早期母婴分离可导致成年大鼠认知功能受损,电针百会和印堂穴可通过调节海马区SC-CA1突触LTP,影响海马突触可塑性而有效改善生命早期母婴分离可导致成年期认知功能障碍。（3）高通量测序结果显示电针改善生命早期母婴分离导致的抑郁样症状可能与差异表达基因（complexin 3、ras-related protein Rab-1B-like、synaptotagmin VI和uncoupling protein 3）有关,差异表达基因涉及的多条相关信号通路如神经递质分泌、转化等可能是针灸改善生命早期母婴分离导致的成年期抑郁样症状重要作用通路。（4）以上三个实验结果提示,电针百会和印堂穴改善生命早期母婴分离导致的成年大鼠抑郁样症状的作用可能是通过多个靶点,多条通路起作用的。下阶段研究可以在增加高通量测序样本量分析结果的基础上进行针对性地实验设计,以验证电针干预发挥疗效的作用机制。总之,本研究结果提示电针百会和印堂穴为临床治疗生命早期应激导致的成年期抑郁症的提供了可能的有效方案,本研究为临床针灸治疗生命早期母婴分离导致的成年期抑郁症提供了实验依据。