目的CRISPR/Cas9是一种新型的基因编辑技术,其操作简单、可对基因组特定位点进行切割,但存在一定的脱靶性,有待深入探讨。本论文通过建立一种不受序列限制且酶切连接反应一步进行的分子克隆方法,构建Cas9蛋白在大肠埃希菌和耻垢分枝杆菌中的表达质粒,同时构建在耻垢分枝杆菌中表达结核分枝杆菌Clp C2蛋白和m Cherry荧光蛋白的质粒;在此基础上,构建一种在细菌体内通过同源重组和具有同源臂的荧光报告基因m Cherry对Cas9蛋白及不同的guide RNA设计对靶标序列的切割效率、脱靶效应等的检测系统。为后续深入研究CRISPR/Cas9系统的脱靶效应、guide RNA的设计及其生物学应用奠定实验基础。方法1.设计含有甲基化位点的引物,PCR目的基因和载体。将扩增得到的片段进行纯化,目的片段与载体PCR产物取相同摩尔数混合;利用识别甲基化C的Fsp EⅠ内切酶,向混合均匀的PCR产物中加入T4 DNA连接酶、Fsp EⅠ内切酶、activator、Fsp EⅠ内切酶buffer,以及ATP混匀,快速构建重组质粒p Tac-Cas9、p MV261-Cas9、p MV261-Clp C2及p MV261-m Cherry。分别将重组质粒p Tac-Cas9转化至E.coli DH5α;p MV261-Cas9、p MV261-Clp C2以及p MV261-m Cherry转化至耻垢分枝杆菌,利用Western-blot检测其蛋白的表达活性。2.通过在荧光报告基因mCherry的ORF中插入了guide RNA的靶标序列,并在靶标序列的两侧预留了不同长度的上下游同源编码区,利用Cas9蛋白切割,被隔开的m Cherry基因通过同源重组的方式进行自我修复,用肉眼直接观察是否出现红色菌落判断其修复功能。在此基础上,设计了与靶标序列互补长度不同的guide RNA以及向guide RNA添加与靶标序列不配对的碱基进行切割实验,利用抗性平板筛选,最后通过红色菌落进行计数,用SPSS软件进行分析。结果1.利用Fsp EⅠ内切酶和T4连接酶一步反应的分子克隆方法,成功构建了在大肠埃希菌DH5α的表达质粒p Tac-Cas9,测序鉴定正确,Western-blot检测结果显示Cas9蛋白在DH5α中表达成功;此外,利用该技术构建了可在分枝杆菌中表达的质粒p MV261-Cas9、p MV261-Clp C2及p MV261-m Cherry,并在耻垢分枝杆菌中成功表达Clp C2和m Cherry蛋白,但p MV261-Cas9转化耻垢分枝杆菌不成功,原因有待进一步研究。2.通过在荧光报告基因mCherry的ORF中插入了guide RNA的靶标序列,并在靶标序列的两侧预留了不同长度的上下游同源编码区,通过Cas9蛋白切割实验发现,没有同源区域的质粒被切割后无红色菌落。而包含42bp、78bp、136bp同源区的质粒被Cas9切割后可以有效重组,经过红色菌落计数,发现具有相似的重组效率;与靶标序列互补长度不同的guide RNA,结果显示配对区域为19bp具有最高的切割效率,20bp次之,其他长度效率依次降低;向guide RNA添加与靶标序列不配对的碱基进行切割实验,发现guide RNA相比靶标序列突变的碱基位置位于倒数第二位或第六位(5′-3′)仍能被Cas9切割,出现脱靶效应。结论1.成功建立了一种不受序列限制、酶切连接反应一步进行的分子克隆方法,构建了在大肠埃希菌DH5α中的表达质粒p Tac-Cas9、分枝杆菌中的表达质粒p MV261-Cas9、p MV261-Clp C2及p MV261-m Cherry质粒,并在大肠埃希菌DH5α中表达了Cas9蛋白,同时在耻垢分枝杆菌中表达了Clp C2蛋白。2.成功建立了一种在细菌体内利用同源重组和具有同源臂的荧光报告基因m Cherry对Cas9蛋白及不同的guide RNA设计对靶标序列的切割效率、脱靶效应的检测系统。