论文部分内容阅读
在西方国家，大肠癌的发病率和死亡率高居消化道恶性肿瘤的第一位，在中国近期的研究中也表明，大肠癌的发病率在逐年上升。近30年来，虽然人们对大肠癌的治疗进行了多方面的探索和努力，但是传统的治疗方法均未使大肠癌的5年生存率有明显的改善。基因治疗是当代肿瘤治疗的一个新的研究领域，它通过各种方法导入不同的目的基因，利用基因产物的功能直接或间接杀死肿瘤细胞。但目前的方法还不能达到彻底清除体内所有肿瘤细胞的疗效。联合治疗已成为目前肿瘤基因治疗的发展方向，中医中药与基因治疗相结合的中西医结合综合治疗正越来越受到重视。杭白菊作为本地中草药特产，其提取液内含有多种黄酮类化合物，具有广泛的生物学活性，如：抑制多种化学物质的诱变作用；较强的抗氧化作用；提高动物的免疫功能；抗促癌及诱导癌细胞分化的作用，而对正常繁殖速率的人体细胞则几乎无影响，其中抗肿瘤作用尤其引人关注。而肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)作为TNF家族的新成员，具有大量、快速诱导凋亡的作用，且其仅诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡，而正常细胞能逃逸它的杀伤作用的特性，使得它在肿瘤的基浙江大学医学院硕士学位论文因治疗中有广泛的应用前景。 本实验联合应用杭白菊提取液和端粒酶(hTERT)启动子驱动下肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体基因，作用于人大肠癌细胞株DLD一1，体外观察联合应用对肿瘤细胞的凋亡诱导及杀伤作用，来探索传统中药与现代基因治疗联合应用治疗肿瘤的新途径。材料与方法实验材料细胞系:人胚肾细胞株293细胞，大肠癌细胞株DLDI;腺病毒载体:A的TERT一gTRAIL，A出CMv一GFP(载体对照);其它:细胞培养材料，各种实验试剂、耗材和仪器等。实验方法l)病毒扩增、纯化、鉴定和滴度测定:重组腺病毒Ad小TERT一gTRAIL及A出CMV一GFP MOI 100感染人胚肾细胞株293细胞，当细胞病变明显时，收集细胞，反复冻融三次后，用CsCI超速梯度离心法纯化，分光光度仪在260nln处测OD值换算得病毒滴度。2)转基因表达检测:将1 xlo，个DLDI细胞接种于六孔板每孔，接种24小时后以MOI 500分别感染Ad/hTERT一gTRAIL、Ad/CMV一GFP(阳性对照)、各浓度杭白菊提取液(3.75ug/ul、7.sug/ul、15ug/ul、3oug/ul共4组)与500MOI的Ad小TERT一gTRAIL混合组、各浓度杭白菊提取液 (3 .75uglul、7.sug/ul、15ug/ul、30ug/ul共4组)与500MOI的Ad/eMV一GFp混合组、各浓度杭白菊提取液组(3.75ug/ul、7.sug/ul、15ug/ul、3oug/ul共4组)和pBS(空白对照)，感染后48小时，收集细胞，流式细胞仪检测G即表达。3)细胞生长曲线:将5xl03个DLDI细胞接种于96孔板每孔，接种后浙江大学医学院硕士学位论文24小时，将细胞分为6大组:Mol 500感染A的TERT一gTRAIL组;Mol 500感染AdiCMV一GFP组;各种浓度杭白菊提取液组(3 .75u留ul、7.sug/ul、1 sug/ul、30ug/ul共4组);各浓度杭白菊提取液(3.75ug/ul、7 .sug/ul、15ug/ul、30ug/ul共4组)与SOOMOI的Ad/hTERT一gTRAIL混合组;各浓度杭白菊提取液与sooMol的A出CMV一GFP混合组和空白对照组(PBS组)。每一组设立4个平行孔，在感染后的48小时，用MTT法测各组细胞生长抑制率。4)凋亡检测:6孔板每孔接种DLDI细胞1 x 105个，接种后24小时，也将细胞分为6大组:Mol 500感染A姚TERT一gT队IL组;Mol 500感染A出CMV一GFp组;各种浓度杭白菊提取液组(3.75ug/ul、7.sug/ul、15ug/ul、30ug/ul共4组);各浓度杭白菊提取液与500MOI的Ad小TERT一gTRAIL混合组;各浓度杭白菊提取液与500MOI的A山CMV一GFP混合组和空白对照组(P BS组)。随后每天用倒置显微镜观察细胞形态变化:感染后48小时，收集细胞，用PI染色法在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。5)统计学处理:所有的数据都采用SPSS 1 0.0数据包进行分析，结果以(社、)和95%可信区间表示，定尸<0.05为显著性差异。结果与讨论1.病毒经扩增、纯化及鉴定后，用光密度值法测得A的TERT一gTRAIL，A出eMv一GFP病毒滴度均为1 x 10”partieles/ml。2.GFP/TRAIL转基因表达:A的TERT一gTRAIL和A出CMv一GFP作用48小时后，可在倒置荧光显微镜下看到GFP蛋白的显著表达，流式细胞仪上检测G即表达，A的TERT一gTRAIL和A出CMV一GFP的GFP表达率浙江大学医学院硕士学位论文分别为82.53%和83.2%，而且与低浓度的杭白菊合用，GFP表达率也分别高达79.9%和85.1%，表明TRAIL基因在该载体系统中，能很好的在细胞内表达，联合低浓度杭白菊的应用不影响病毒的感染及基因表达。3.杭白菊及TRAIL对大肠癌DLDI细胞生长的影响:MTT结果显示，单独使用浓度分别为3.75ug/ul、7.sug/ul、15ug/ul、30ug/ul杭白菊提取液及500Mol的A姚TERT一gTRAIL对DLDI细胞的生长抑制率分别为10.9%、22.8%、27.8%、35.4%和31.4%;与PBS组有显著差异(P<0.05)，各TRAIL基因组与各相应CMV对照组比较有显著差异，说明TRAIL基因及杭白菊提取液对细胞生长有抑