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结直肠癌在世界范围内的发病率在男性和女性分别位列第三位和第二位,死亡率分别位列第四位和第三位。结直肠癌已经成为严重危害社会和谐与稳定的公共卫生问题之一,找到有效的预防和治疗结直肠癌的措施具有重要的经济和社会意义。化疗是治疗结直肠癌的主要手段之一,5-氟尿嘧啶(5-FU)则是治疗消化系统肿瘤,特别是结直肠癌和胃癌的基础药物之一。5-FU是胸苷酸合成酶抑制药,在体内通过抑制脱氧胸苷酸合成酶阻止脱氧鸟苷酸甲基化变为脱氧胸苷酸,从而抑制DNA的合成,促进细胞凋亡。5-FU对DNA合成迅速、细胞增殖活跃的肿瘤细胞有很好的杀灭效果,但是同时也对正常细胞产生影响;5-FU治疗存在很大的个体差异,因此如何对结直肠癌患者实施精准治疗是目前该领域研究的热点。葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78),又名免疫球蛋白重链结合蛋白(the immunoglobulin heavy chainbingding protein,Bip),是热休克蛋白70家族的成员之一,作为一种分子伴侣蛋白在蛋白质的折叠和转运过程以及内质网应激和未折叠蛋白质反应中发挥着重要的生物学功能。当细胞受到刺激(如葡萄糖缺乏、缺氧等)或者机体处于病理状态时,细胞微环境发生紊乱就会激活GRP78基因转录,诱导GRP78合成增加。研究表明,GRP78在多种肿瘤如肠癌中呈现高表达。由于GRP78对肿瘤细胞也有保护作用,通过抑制应激反应过程中产生的大量GRP78也可抑制肿瘤细胞增殖,促进其凋亡。因此,GRP78作为肿瘤治疗的靶点或组成部分具有广泛的临床应用前景。JWA作为一种环境应答基因,其编码蛋白主要定位于细胞内质网。已证明JWA基因在顺铂、As2O3诱导的肿瘤细胞凋亡过程中均发挥着重要的作用。本研究中,我们在了解了 JWA蛋白在结直肠癌组织表达规律的基础上,深入探讨JWA参与5-FU诱导结直肠癌细胞凋亡的作用及分子机制。目的:探讨JWA通过GRP78调节5-FU诱导肠癌细胞凋亡的作用及其分子机制研究。方法:采用蛋白免疫印迹和实时定量PCR技术检测JWA和GRP78在肠癌组织和癌旁正常组织中的表达水平。通过蛋白免疫印迹法、免疫荧光技术分析肠癌细胞中JWA和GRP78的表达水平及细胞内定位情况;利用CCK-8法、蛋白免疫印迹法、TUNEL凋亡试剂盒等检测细胞增殖和细胞凋亡情况和细胞凋亡相关基因的表达水平;通过免疫荧光技术和免疫印迹法检测细胞自噬相关标志物的表达水平。结果:1、JWA正调控GRP78表达。通过Western blot和qRT-PCR实验检测7对肠癌组织和癌旁正常组织中JWA和GRP78的蛋白和mRNA水平,我们发现JWA和GRP78的水平在肠癌组织中显著高于癌旁正常组织。继而我们发现JWA和GRP78蛋白水平在肠癌细胞DLD-1中较高,而在SW480细胞中较低,但是免疫荧光结果显示JWA和GRP78在DLD-1细胞中并没有明显的共定位现象。Western blot实验结果证明了 DLD-1细胞中转染JWA siRNA后GRP78表达水平下降了 20%,而在SW480细胞转染Flag-JWA质粒后GRP78表达水平升高了 0.68倍。2、JWA增强5-FU诱导的细胞凋亡。Western blot实验显示DLD-1和SW480细胞中JWA和GRP78的表达水平随着5-FU处理时间的延长而升高。通过CCK-8、Western blot和TUNEL实验我们证明了干涉DLD-1细胞中JWA表达后可抵抗5-FU诱导的细胞凋亡;同时我们观察到增加SW480细胞中JWA表达后可明显促进5-FU诱导的细胞凋亡。3、JWA增强5-FU诱导的细胞自噬。Western blot实验我们证明了 DLD-1和SW480细胞中LC3B的表达水平随着5-FU处理时间的延长而升高;DLD-1细胞转染JWA siRNA后在5-FU处理下细胞自噬减轻;同时我们观察到SW480细胞转染Flag-JWA质粒后在5-FU处理下细胞自噬加重。我们在DLD-1 和 SW480细胞中共转GFP-RFP-LC3 质粒和 JWA siRNA或Flag-JWA质粒后激光共聚焦下观察到降低JWA表达的DLD-1细胞中自噬小体减少了 80%,升高JWA表达的SW480细胞中自噬小体增加了 2.25倍。4、JWA通过GRP78促进5-FU诱导的细胞凋亡。Western blot实验结果显示在低表达JWA的DLD-1细胞中转染Flag-GRP78质粒后细胞凋亡加重,而在高表达JWA的SW480细胞中转染GRP78 siRNA后细胞凋亡减轻,这些结果说明GRP78能部分逆转JWA促进的细胞凋亡。5、JWA通过MEK/ERK/TFⅡ-Ⅰ信号轴正调控GRP78表达。qRT-PCR实验发现JWA是通过转录途径上调GRP78表达。Western blot实验结果显示JWA能促进TFⅡ-Ⅰ的本底及其磷酸化水平表达,浆核分离实验证明了 DLD-1细胞转染JWA siRNA后细胞核中TFⅡ-Ⅰ水平降低了 36%;SW480细胞转染Flag-JWA质粒后细胞核中TFⅡ-Ⅰ水平升高了 0.53倍。而在SW480细胞中转染TFⅡ-Ⅰ siRNA后GRP78降低,细胞凋亡减轻。在SW480细胞中使用MEK/ERK通路的抑制剂U0126后能显著抑制p-TFⅡ-Ⅰ及下游GRP78的表达,最终抑制细胞凋亡。结论:本研究发现肠癌组织中JWA和GRP78表达水平均显著高于癌旁正常组织。通过研究初步阐明了 JWA对GRP78具有正向调节作用,其机制是通过MEK/ERK-TFⅡ-Ⅰ通路实现的;JWA上调GRP78显著促进5-FU诱导的肠癌细胞凋亡。因此,JWA对GRP78的调节作用对于5-FU实际起到了增敏的效果,具有潜在的转化应用价值。