骨髓间充质干细胞是目前再生医学及组织工程中应用广泛并且最有潜力的治疗手段。然而,骨髓间充质干细胞比较难以获得并且在移植入体内后常常犬量死亡,存活率低下,这是骨髓间充质干细胞在临床及再生医学中大量使用的最大限制。本课题着重研究了富血小板血浆(一种自体源性的复合生长因子)对骨髓间充质干细胞的作用。富血小板血浆通过激活PI3K-AKT-NFκB信号通路,降低了骨髓间充质干细胞在恶劣环境条件的凋亡,促进了其存活率及其再生的功能。这些作用都是通过促进骨髓间充质干细胞的旁分泌功能完成的。本课题分体外及体内两大部分。体外实验部分主要是通过体外诱导氧化应激,研究富血小板血浆对骨髓间充质干细胞的抗凋亡的作用及其抗凋亡的机制。体内实验主要研究富血小板血浆处理后的骨髓间充质干细胞移植入皮肤缺损创面后,在体内的存活及其对创面的再生愈合(表皮,真皮,血管等)促进作用。第一部分(离体)富血小板血浆激活内在机制对抗骨髓间充质干细胞凋亡目的研究离体氧化应激状态下,富血小板血浆对抗骨髓间充质干细胞凋亡,促进其存活的现象,同时探讨其内在的机制。方法体外诱导氧化应激条件--血清饥饿后双氧水处理骨髓间充质干细胞,MTT毒性检测诱导的最佳条件及富血小板血浆的最佳浓度；在最佳诱导条件下,进一步研究富血小板血浆对骨髓间充质的抗凋亡作用,主要采取凋亡检测、TUNEL染色方法验证细胞凋亡和凋亡率及TYPAN blue染色法排除细胞存活及存活率；同时研究凋亡蛋白Bcl-xl及p-Bad的表达情况。为深入探讨其抗凋亡机制,采用免疫细胞化学及ELASA实验证明富血小板血浆是否具有促进骨髓间充质干细胞旁分泌的作用---主要研究生长因子VEGF和PDGF;同时检测到富血小板血浆对骨髓间充质干细胞表面受体PDGFR的表达的影响；采用RT-PCR, Western blot,免疫细胞化学深入研究了富血小板血浆是否激活了骨髓间充质干细胞内的信号通路PI3K-AKT-NFκB或JAK/STAT3;通过反证法,阻断PDGFR、PI3K、AKT,(LY294002,AG1295,SC66)研究富血小板血浆对骨髓间充质干细胞的一系列的作用：包括抗凋亡,促进旁分泌等作用是否改变。结果1、10um/ml的H202是体外最佳诱导氧化应激的条件；10%PRP及20%PRP是促进增殖的最佳浓度；2、通过MTT, APOPTOSIS, TUNEL, TYPAN BLUE等检测证明了PRP的有效抗凋亡的作用,以10%或者20%的浓度为最佳；3、检测细胞内的凋亡蛋白,PRP预处理后的MSC其Bcl-xl表达增高同时p-Bad表达降低,进一步证明PRP的抗凋亡作用；4、深入研究PRP发现其诱导MSC的旁分泌的作用—VEGF及PDGF的表达都增高；并同时检测MSC的表面受体PDGF的表达相应增高；5、PRP预处理激活了信号通路PI3K-AKT-NFκB;6、阻断整个信号通路,PRP的抗凋亡,促进分泌作用都明显降低甚至逆反。结论10%PRP预处理促进MSC在体外氧化应激条件下(10um/mlH2O2+血清剥夺)抗凋亡的作用,这种抵抗凋亡作用的机制源于激活MSC内在信号通路PI3K-AKT-NFκB,同时促进MSC分泌VEGF及PDGF的作用。第二部分研究体内移植富血小板血浆预处理后的骨髓间充质干细胞体内存活情况及其再生修复作用目的研究富血小板血浆预处理后的骨髓间充质干细胞体内存活及对急性全层皮肤创面缺损的修复及再生能力方法1.动物模型的建立及分组：SD雄性大鼠24只,8周龄。随机分为三组。头一天晚上各组动物禁食,晨起,备皮。甲苯噻嗪(20mg/kg)及克他命(100mg/kg)麻醉。半小时后,手术剪在大鼠背部中央剪去约2.0x2.0cm大小的皮肤组织,制作皮肤全层缺损模型。本实验动物分组如下,第一组：实验组,皮下移植富血小板血浆预处理后的骨髓间充质干细胞；第二组：实验对照组,移植骨髓间充质干细胞,(无富血小板血浆处理)；第三组：空白对照组,生理盐水处理。各组细胞或盐水量均为200u1.细胞浓度为5×106/ml。移植的骨髓间充质干细胞为大鼠来源的GFP阳性MSC。2.体内移植后检测细胞的存活率及GFP阳性细胞检测：分别于创面愈合的第1,3,5,7,12,22天取下全层皮肤包括皮下筋膜及肌肉,制作标本。一半用于GFP阳性细胞检测。同时运用活体动物成像仪检测创面荧光信号强度。另一半,用于TUNEL染色,检测骨髓间充质干细胞的体内凋亡情况。3.创面愈合情况的检测及显微镜下组织的愈合状况：创面愈合情况每隔3天观察一次,并用数码相机拍照,计算机处理图像信息,运用面积计算法计算每次观察愈合率的情况,创面愈合率=(初始面积-观察面积)／初始面积x100%。微观组织愈合率的评估采用马松染色法,然后在显微镜下观察其创面愈合情况(表皮、真皮愈合)。4.检测表皮再生情况及创面生长因子检测：取第7天及22天的皮肤样品,制作冰冻切片。10μm厚度。冰甲醇固定1小时后,0.1%triton X-100打孔30分钟。然后一抗孵育组织切片1小时；(小鼠抗大鼠a-SMA,VEGF兔抗大鼠CK5,PDGF);荧光标记二抗(Alexa Fluor488-conjugated donkey anti-mouse and FITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG)孵育1-2小时。最后DAPI (Sigma Aldrich)复染后,荧光显微镜下观察。随机选取10个中间区域进行镜下评估。5.机制探讨：免疫组织化学染色,检测各组切片信号通路蛋白的表达情况。同样取7天及22天的组织,4μm厚度标本制作后,福尔马林固定,石蜡包埋,梯度脱水后,烘干。抗原修复半小时,3%双氧水处理切片,PBS反复漂洗4-5次后,一抗孵育：rabbit anti-rat p-AKT1, p-PI3K, NF-κB (1:100; EPITOMICS, Abcam),4度,过夜。第二天,运用辣根过氧化物酶标记的二抗：horseradish peroxidase-coupled goat anti-rabbit IgG (1:1000; Santa Cruz)孵育1-2小时。PBS洗4-5次,最后苏木精复染。树胶封片。显微镜下观察。对比各组蛋白表达情况。结果1、富血小板血浆预处理后的骨髓间充质干细胞在体内的存活率较单独移植的干细胞的存活率明显升高,凋亡率相应降低。2、富血小板血浆组跟其余两组对比,创面愈合率明显升高,组织愈合时间明显缩短；在细胞移植后第16天,创面几乎完全愈合。而其余两组动物创面的愈合率在每个检测点均与富血小板组相比明显低下,并且愈合时间偏长。微观组织愈合状况：富血小板血浆组,表皮再生情况明显较其余两组好,真皮胶原纤维排列规整,胶原粗大。3、富血小板血浆组明显促进创面表皮再生：增强血管再生及密度,(免疫荧光显示a-SMA及CK5的表达明显比其余两组高)；并且创面生长因子浓度VEGF, PDGF也明显比其余两组高。4、信号蛋白的检测：富血小板血浆组信号通路蛋白的表达比其余两组高。这跟体外实验结果相互呼应。证明了体外实验的假设即：富血小板血浆预处理后的骨髓间充质干细胞具有更强的生命力和再生能力,并且这种抗凋亡及再生的功能与其细胞内的PI3K-AKT-NF-κB信号通路被激活密切相关。结论富血小板血浆预处理后的骨髓间充质干细胞移植入全层缺损的大鼠创面后,具有较好的存活率,能显著降低创面内细胞的凋亡率；并且能促进骨髓间充质干细胞的体内再生的功能,这种功能与骨髓间充质干细胞的分化无关,研究证明可能是通过促进骨髓间充质干细胞旁分泌的作用有关；并且是激活了骨髓间充质干细胞或者创面内的细胞的增殖相关信号通路PI3K-AKT-NF-κB从而产生的连锁放大的效应。