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随着糖尿病的治疗成为全球亟待解决的热点医学问题,具有降血糖作用的天然活性成分—多糖受到国内外研究学者越来越多的关注,然而由于多糖分子量大、结构复杂,解析过程繁复,为进一步研究利用带来了阻碍。山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）作为我国一味传统中药,用于治疗消渴症、糖尿病已有数千年的历史。药理学研究表明,许多含有山茱萸的降糖古方和山茱萸中的活性成分,都具有明显的降低血糖的作用,但目前山茱萸多糖的结构和糖尿病治疗活性尚未深入研究。本课题通过分离获得5种山茱萸均一性多糖,并对其进行理化性质研究、单糖组成分析和一级结构解析,进而应用体内和体外模型初步探究山茱萸多糖对2型糖尿病的治疗活性和降血糖作用,为开发治疗2型糖尿病的天然药物奠定基础。方法:1.本研究通过水提醇沉法制备山茱萸总多糖（PFC）,进而通过离子交换和尺寸排阻色谱法制备得到5种山茱萸均一性多糖PFC-1、PFC-2、PFC-3、PFC-4和PFC-5。采用高效尺寸排阻色谱（HPSEC）法测定五种山茱萸多糖的均一性和分子量,苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考马斯亮蓝法分别测定其总糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量,红外（IR）法初步分析多糖主要官能团。2.运用高效液相色谱（HPLC）法测定五种山茱萸均一性多糖的单糖组成;用三氟乙酸（TFA）制备多糖的部分酸水解产物;甲基化和气质联用仪（GC-MS）分析多糖的糖苷键类型;一维（1D）和二维（2D）核磁共振（NMR）分析其糖苷键连接方式。3.构建2型糖尿病大鼠模型和Hep G2细胞的胰岛素抵抗（IR）模型,评价山茱萸多糖体内治疗2型糖尿病的作用和体外对葡萄糖代谢的影响。结果:1.HPSEC结果表明,PFC-1、PFC-2、PFC-3、PFC-4和PFC-5分别为分子量为4.4×10~3、4.0×10~4、8.2×10~4、5.9×10~4和2.6×10~4的均一性多糖,总糖含量分别为98.99%、98.74%、94.65%、58.32%和87.12%,糖醛酸含量分别为0.12%、1.26%、1.19%、65.55%和13.41%,蛋白含量分别为2.41%、3.43%、5.32%、1.25%和2.61%。IR谱中显示了多糖羟基和糖环中C-H的特征吸收峰。2.PFC-1和PFC-3的单糖组成仅有葡萄糖,一级结构为α-D-1,6-Glcp连接的直链多糖;PFC-2的单糖组成及摩尔比为Glc∶Xyl∶Gal（2.41∶12.95∶1.00）,主要糖残基类型为α-D-1,6-Glcp、α-D-1,6-Galp、α-D-1,4-Glcp、α-D-1,3,4-Xylp、α-D-T-Glcp,α-D-1,3,6-Galp和α-D-1,3-Galp;PFC-4的单糖组成及摩尔比为Gal A∶Glc∶Gal∶Xyl∶Rha（27.75∶2.41∶2.49∶6.71∶1.00）,主要糖残基类型为:α-L-1,2-Rhap、α-D-T-Glcp、α-D-1,2,5-xylp、α-D-1,3-Galp A、α-D-1,3-Galp、α-D-1,2,3,6-Galp、α-D-1,3,6-Galp、α-D-1,3,4-Galp和α-D-1,2,6-Galp;PFC-5的单糖组成及摩尔比为Gal A∶Glc∶Xyl∶Gal（1.59∶16.35∶2.86∶1.00）,主要糖残基类型为:α-D-1,4-Glcp、α-D-1,4-Xylp、α-D-1,6-Glcp、α-D-1,6-Galp。3.PFC可以显著降低2型糖尿病模型空腹血糖（FBG）水平,将糖化血红蛋白（Hb A1c）和淀粉酶（Amylase）值恢复到正常水平,并可以显著降低模型大鼠的甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平,升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）值,说明PFC可以改善2型糖尿病大鼠的血糖、血脂异常。此外,经PFC治疗后,模型大鼠的总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）升高,而丙二醛（MDA）水平下降,说明PFC可以增强抗氧化能力。4.在浓度≤100 mg/L,作用24 h时,PFC-1、PFC-3、PFC-4和PFC-5对Hep G2细胞无显著的增殖抑制作用,但作用48 h后,PFC-4和PFC-5对细胞的毒性升高,增殖率分别下降至67.1%和61.4%。PFC-2的增殖抑制作用较强,在低浓度时对Hep G2细胞就存在一定的细胞毒性,浓度为300 mg/L,作用48 h时,增殖率仅为50.64%。5.利用葡萄糖摄取实验对5种山茱萸多糖进行活性评价发现在生理状态下,10mg/L和30 mg/L的PFC-2和PFC-4对Hep G2细胞的葡萄糖摄取有显著的促进作用,且30 mg/L的PFC-2和PFC-4的促进效果优于罗格列酮;在胰岛素抵抗（IR）状态下,PFC-2和PFC-4均可显著促进Hep G2细胞的葡萄糖摄取并且呈浓度依赖关系,且二者30 mg/L浓度的促进效果和罗格列酮组无显著性差异。葡萄糖消耗实验表明,生理状态下,PFC-2和PFC-4对Hep G2细胞葡萄糖消耗的促进作用显著且呈现浓度依赖关系,30 mg/L时,为对照组的2.8倍,作用效果与罗格列酮相当;在IR状态下,PFC-2对葡萄糖消耗的促进作用显著但无浓度依赖关系,PFC-4呈现剂量依赖关系,在30 mg/L时细胞葡萄糖消耗量为对照组的3.98倍。结论:1.本实验分离获得了5种均一性山茱萸多糖,分别命名为PFC-1、PFC-2、PFC-3、PFC-4和PFC-5。PFC-1和PFC-3的一级结构分别为[→6)-α-D-Glcp-(1→]24,[→6)-α-D-Glcp-(1→]456;PFC-5可能的一级结构为:[→4)-α-D-Galp A（1→6）-α-D-Glcp-（1→4）-α-D-Xylp-（1→6）-α-D-Glcp-（1→4）-α-D-Glcp-（1→6）-α-D-Glcp-（1→4）-α-D-Glcp-（1→6）-α-D-Glcp-（1→6）-α-D-Glcp-（1→6）-α-D-Galp-(1→]14;PFC-2的主要糖残基类型及摩尔比为α-D-1,6-Glcp∶α-D-1,6-Galp∶α-D-1,4-Glcp∶α-D-1,3,4-Xylp∶α-D-T-Glcp∶α-D-1,3-Galp∶α-D-1,3,6-Galp（11.37∶7.26∶6.57∶60.26∶10.56∶4.17∶1.00）;PFC-4中可能含有的糖链结构为T-Glcp-（→1）-Rhap-（2→1）-Xylp-(2,5→和T-Glcp-（→1）-Galp-（3,4→1）-Galp A-（3→1）-Galp-（3→）-T-Glcp。2.PFC具有显著的2型糖尿病治疗作用,其中PFC-2和PFC-4是PFC的主要活性多糖;PFC-2和PFC-4可显著促进正常和IR状态下的肝细胞葡萄糖摄取和消耗。