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苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，简称PAL，EC4.3.1.5)为胞内诱导酶，存在于所有植物与部分微生物中，因其可逆催化反式肉桂酸生成L-苯丙氨酸而被应用于工业化生产苯丙氨酸。随着研究的深入，苯丙氨酸解氨酶的其他潜在工业及临床医药价值也不断被发掘出来。本课题筛选出一株产苯丙氨酸解氨酶的红冬孢酵母Y01，通过RT-PCR扩增其苯丙氨酸解氨酶基因pal，分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行异源表达，并对重组大肠杆菌的发酵培养条件进行研究，取得具体结论如下：1、利用底物的结构类似物L-酪氨酸筛选出一株产苯丙氨酸解氨酶的菌株，通过菌株形态特征及26S rDNA鉴定其为红冬孢酵母属，在诱导培养基中培养20h后PAL酶活达到最高值10.670.49U/L。2、比较了Trizol法、玻璃珠法及热酸性酚法等5种酵母总RNA提取方法，最终确定以热酸性酚法提取红冬孢酵母总RNA，并以此总RNA为模板，通过反转录和PCR扩增获得红冬孢酵母pal基因，与NCBI上公布的红冬孢酵母PAL序列进行比对，其氨基酸相似度达99%。3、构建重组表达载体pET28a(+)-pal及pPIC9K-pal，并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)及毕赤酵母GS115，经SDS-PAGE检测表达产物，重组大肠杆菌破碎液上清于76kDa处有一特异性蛋白条带，与公布的PAL蛋白大小相同，经检测重组大肠杆菌具有PAL酶活力。毕赤酵母发酵上清于76kDa处有蛋白条带，但未能检测到酶活。4、以LB为培养基考察IPTG诱导重组大肠杆菌产酶的最佳条件，单因素实验优化的最佳发酵条件为：诱导起始时间为发酵3h，IPTG终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导16h后，酶活达到最高值45.810.17U/L，较原始菌提高了4.3倍。对比前人所构建的重组大肠杆菌，单位菌体酶活提高了22.8%。5、考察了以TB为培养基、乳糖进行诱导的发酵条件。确定初始甘油浓度为2g/L、乳糖添加量为1.5g/L，25℃进行诱导。进行15L发酵罐实验，通过对乳糖添加时间、甘油流加方式两方面进行研究，最终PAL酶活可达到6103.97U/L，较最初的15L分批发酵酶活提高了约5.3倍，较原始菌红冬孢酵母酶活提高了57.2倍。6、研究了重组大肠杆菌生物转化实验。最佳催化条件为：pH10.5，温度30℃，反式肉桂酸浓度为12g/L，氨水浓度为40%（V/V）。最终肉桂酸转化率可达62.371.33%，经测定反应液中苯丙氨酸含量为2.25g/L。