狂犬病病毒(RABV)和犬瘟热病毒(CDV)是犬等食肉动物危害最大的病原体。狂犬病是由RABV引起的噬神经的高病死率的病毒病。目前,狂犬病仍在150个国家流行。每年大约5.9万人死于狂犬病感染,其中亚洲和非洲的病例占95%。在中国,人类狂犬病病例的95%是由感染RABV的犬咬伤引起的,尤其是在经济欠发达的农村地区。我国已经制定了到2030年消灭由犬传播的人类狂犬病的目标。按照2011年发表的数据,中国狂犬病疫苗的投入主要用于人在被犬咬伤后被迫接种疫苗和抗血清的费用,耗资达100亿元,这个数量超出全球生产所有狂犬病疫苗的80%。中国每年为狂犬病付出的代价是世界第一,而每年狂犬病发病人数却居世界前列。世界卫生组织(WHO)调查显示,为70%的犬连续7年接种疫苗能阻断狂犬病的传播[1-2]。因此,中国急需高效、廉价的狂犬病疫苗,提高犬的免疫覆盖率,从源头阻断病毒传播。犬瘟热是由CDV引起的高致病性、高传染性的疾病,表现为严重的免疫抑制和多系统临床症状,包括呼吸系统、胃肠系统、中枢神经系统等。犬瘟热感染的宿主广泛,包括犬科、猫科、浣熊科、熊猫科、灵猫科、鼬科、臭鼬科及海豹科等动物,甚至在非人类灵长类动物也有犬瘟热感染的报道。有研究指出犬瘟热与人类疾病有关。研究者在Paget畸形骨炎患者骨骼中检出CDV,检出率达100%,表明Paget畸形骨炎与CD感染显著相关[3],Paget畸形骨炎在欧美国家发病率达5%。动物感染CDV后病死率达30%～80%,其中雪貂最为敏感,病死率几乎达100%。犬瘟热的传染性强,通过直接接触传播,也可以通过空气飞沫传播。犬瘟热是危害养犬业最严重的的病毒性传染病,严重影响着狐狸、貂等动物毛皮养殖业发展。犬在犬瘟热传播中占主要地位,感染CDV的犬是狐狸、貂等动物感染CDV的主要传染源。犬瘟热疫苗是犬、狐狸、貂等必须免疫的疫苗,而我国目前所用的犬瘟热疫苗大多是进口疫苗,价格昂贵,因此有必要研制安全、有效、廉价的犬瘟热疫苗。RABV和CDV感染的共同宿主多,包括与人密切接触的家养动物犬及观赏动物虎、豹、狮、熊猫、非人类灵长类动物等。犬在狂犬病和犬瘟热疾病传播中有重要的作用。狂犬病和犬瘟热可以通过疫苗接种达到一级预防,减轻疾病负担。有必要研制一种二联疫苗,同时保护机体免受两种病毒感染。目前在中国,应用上市的狂犬病疫苗是细胞培养灭活疫苗,而批准使用的犬瘟热疫苗是减毒活疫苗,针对两种疾病的联合疫苗仍然缺乏。人5型腺病毒载体在基因治疗和病毒病防治方面应用广泛,作为病毒载体有诸多优势。首先,腺病毒载体安全性高,缺失E1复制必须区,使病毒只能在E1区互补的细胞系中复制;其次,其能容纳较长的外源基因,同时表达多个基因;另外,应用293细胞培养腺病毒工艺成熟,易于培养,滴度高,能引起较高的免疫反应。2017年,国家食品药品监督管理局(FDA)批准了表达埃博拉病毒糖蛋白的重组人5型腺病毒疫苗的新药上市。2020年,以人5型腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗已进入临床试验Ⅱ期。因此,本研究以缺陷型人5型腺病毒为载体,表达RABV糖蛋白(G)及CDV血凝素蛋白(H),获得重组腺病毒rAd5-G-H,通过体外实验、动物免疫及动物攻毒保护实验,分析rAd5-G-H对机体的保护效果,评价其作为二联疫苗的潜力。研究目的1.以复制缺陷人5型腺病毒为载体,构建一种共表达RABV G蛋白和CDV H蛋白的重组腺病毒rAd5-G-H,作为狂犬病和犬瘟热的候选二联疫苗。2.体外细胞实验验证rAd5-G-H在细胞水平是否表达RABV G蛋白和CDV H蛋白。3.通过小鼠和狐狸动物模型评价rAd5-G-H的毒力、免疫原性和保护性,为新型狂犬病和犬瘟热二联疫苗研制提供科学依据。研究方法1.重组腺病毒rAd5-G-H的构建与鉴定。将RABV G基因和CDV H基因重组至复制缺陷人5型腺病毒构建重组腺病毒rAd5-G-H。通过基因组PCR、电镜观察、间接免疫实验等方法鉴定rAd5-G-H的滴度、形态与目的基因的表达。2.rAd5-G-H毒力鉴定。6～8周龄雌性BALB/c小鼠后肢肌肉注射rAd5-G-H,连续21天监测小鼠体重、毛色、饮食情况,评价疫苗的毒力,为初步评价疫苗安全性提供依据。3.rAd5-G-H体内诱导中和抗体能力检测。6～8周龄雌性BALB/c小鼠后肢肌肉注射rAd5-G-H,分别在免疫后第1、2、4和8周采血,分离血清。利用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)测定RABV中和抗体(VNA)效价,用50%荧光减少中和实验(FRNT)测定CDV VNA。6周龄雌性银狐肌肉注射rAd5-G-H,用同样的方法测定免疫后第0、2、3和4周血清中RABV和CDV VNA,在狐狸体内评价rAd5-G-H的免疫原性。4.rAd5-G-H诱导小鼠募集活化DC细胞及B细胞能力检测。在免疫后3、6和9天分离小鼠腹股沟淋巴结淋巴细胞,并且在免疫后7天和14天采集小鼠外周血。通过流式细胞术检测rAd5-G-H诱导小鼠募集和/或活化DC细胞和B细胞的情况。5.rAd5-G-H诱导小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞因子能力的检测。在免疫后4周分离小鼠脾脏淋巴细胞,使用ELISpot试剂盒检测在特异性刺激物RABV蛋白颗粒和原核表达的CDV H蛋白存在时,rAd5-G-H诱导小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4细胞因子的能力。用ELISA法测定免疫小鼠血清中特异性IgG2a和IgG1抗体水平。6.rAd5-G-H对RABV和CDV感染的保护能力检测。6～8周龄雌性BALB/c小鼠后肢肌肉注射rAd5-G-H后4周,一侧后肢肌肉注射RABV HNPB3株。6周龄雌性银狐肌肉注射rAd5-G-H后4周,异侧后肢肌肉注射CDV QL。在攻毒后21天,观察小鼠和狐狸毛色、行为及死亡情况,评价重组腺病毒对小鼠和狐狸的保护率。研究结果1.重组腺病毒rAd5-G-H获得成功拯救,并且在细胞水平上验证了该重组腺病毒可以同时表达RABV G和CDV H蛋白。通过负染电子显微镜观察,重组腺病毒rAd5-G-H与腺病毒载体对照病毒表面光滑,形态都呈典型的二十面体结构,大小约为70～100nm。2.与空白组和病毒对照组相比,rAd5-G-H组小鼠体重变化轻微,未出现异常行为和疾病症状。3.rAd5-G-H引起免疫小鼠和狐狸产生强烈的RABV和CDV VNA,重组腺病毒的免疫原性良好。4.流式细胞术结果显示,与空白组和病毒对照组相比,rAd5-G-H能诱导小鼠募集和/或活化DC细胞和B细胞。5.ELISpot实验表明,在RABV蛋白颗粒和原核表达的CDV H蛋白刺激后,rAd5-G-H免疫组的小鼠脾脏中淋巴细胞可分泌明显增多的IFN-γ Th1型细胞因子和IL-4 Th2型细胞因子。ELISA结果表明,rAd5-G-H可刺激小鼠产生高水平RABV和CDV特异性IgG2a和IgG1抗体水平。6.攻毒实验表明,rAd5-G-H能够完全保护免疫小鼠抵御RABV的致死性攻击,并能完全保护狐狸抵御CDV的致死性攻击。结论本研究制备了缺陷型人5型腺病毒rAd5-G-H,能刺激机体产生特异性体液免疫及Th1型和Th2型细胞免疫应答,能够保护小鼠抵抗RABV的致死性攻击,保护狐狸抵抗CDV的致死性攻击,是狂犬病和犬瘟热二联疫苗的理想候选疫苗。