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新城疫又称亚洲鸡瘟,是由新城疫病毒（NDV）所引起的严重危害养禽业的主要疫病之一。在OIE被列为A类疫病,在我国被列为一类疫病。NDV属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属,是一种具有囊膜、单链负股RNA病毒。NDV属二类病原微生物,易发生变异,其宿主范围广泛,新致病型不断出现。本研究拟通过克隆三种不同禽源NDV部分基因（F、HN、NP、M）进行序列分析,在分子水平上探讨WF00C、 WF00D、WF00G株的分类地位、毒力、特点及进化关系,近而为解释NDV的演化提供依据。采用假病毒系统构建具有新城疫病毒囊膜糖蛋白一次性感染能力的假病毒,为NDV囊膜蛋白基因的功能及细胞融合活性的研究奠定基础。1.不同禽源新城疫强毒株F、HN基因的克隆与序列分析分别对鸡源、鸭源、鹅源NDV强毒分离株（WF00C、WF00D、WF00G）的F基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行分析。结果表明,各分离株F基因均含1个完整的开放阅读框（ORF）,全长为1662bp,编码553个氨基酸,有6个潜在的糖基化位点,裂解位点区的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒株特征相符,具有第101位的K（赖氨酸）和121位的V（缬氨酸）,符合基因Ⅶ型NDV特征；WFooC株有13个半胱氨酸（Cys）残基,WF00D株和WF00G株各有12个Cys残基；在限制性内切酶（RE）位点（nt334-1682）的分布上,三个毒株均存在多数鹅源分离株特有的973nt和1249nt Rsa Ⅰ位点；WFooD株与WFooC株、WFooG株以及Genebank下载的15株各基因型代表株的F基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源率为84.7～99.3%,推导的氨基酸序列同源率为88.4～98.9%；各分离株HN基因均含1个完整的（?）ORF, ORF全长为1716bp,编码571个氨基酸。WF00D洙与WF00C株、WF00G株以及Genebank下载的15株各基因型代表株的HN基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源率为84.0～100.0%,推导的氨基酸序列同源率为88.1～100.0%；三个分离株间的同源性高,均有5个潜在的糖基化位点,13个半胱氨酸残基,且位置均相同。其中鸭、鹅源HN基因序列完全相同,其与ZJ1、SF02和NA1等鹅源毒株之间差异较小而与Lasota、F48E9等毒株之间差异明显。根据NDV系统发育进化树、酶切位点分析以及基因分型结果,证明它们的基因型均为Ⅶd亚型。2.不同禽源新城疫强毒株NP、 P、（?）（?）基因的克隆与生物学特性分析根据GeneBank登录的新城疫病毒P基因序列,设计一对引物,运用RT-PCR技术分别对鸡源、鸭源、鹅源NDV强毒分离株（WF00C、WF00D、WF00G）的P基因进行扩增,将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体后,进行酶切、PCR和测序验证,并对其核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析、系统进化树分析及三个不同禽源分离毒株氨基酸序的比较。结果表明,各分离株NP、P、M基因均含1个完整的开放阅读框（ORF）, ORF总长分别为1470bp、1188bp、1095bp,分别编码489、395、364个氨基酸。鸭源毒株与GenBank下载的各参考毒株的NP、P、M基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源率为85.2～99.4%、81.5～99.7%、84.1～99.7%,推导的氨基酸序列同源率为90.6～99.4%、80.1-99.7%、86.1～99.7%；三个不同禽源分离株间的同源性较高,其与近年分离的ZJ1、SF02和NA1等鹅源毒株和PX2/03、Duck/1/05、FP1/02等鸭源毒株之间差异较小,系统进化树分析表明,同属于基因Ⅶ型新城疫病毒；与Lasota、F48E9等经典毒株之间差异明显,说明该毒株相对于经典的禽源NDV在NP、P、M基因上均亦有较大的变异。各氨基酸序列的比对情况与核苷酸序列比对差异较小。通过比较不同禽源毒株在NP、P、M基因的变异情况,显示出高度的一致性,同时揭示了不同禽源间NDV病毒互感变异的存在,且各个基因的变异是同步的。其中P基因在NDV Ⅶd亚型中存在特征性氨基酸序列。3.新城疫病毒假型病毒体系的构建及生物活性分析根据已获得的鸡源F、HN的基因核苷酸序列设计一对含Flag标签蛋白编码序列PCR引物,其5’端分别引入EcoRI/SalI酶切位点,以T克隆重组质粒pMDC-F、 pMDC-HN为模板,PCR扩增NDV F、HN基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1（+）中,构建重组真核表达质粒pcDNA-JF-Flag、pcDNA-JHN-Flag。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的HIV-1基因组重组质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染HEK293T细胞,收获NDV假病毒上清,感染293T细胞,进行虫荧光素酶（Luciferase）报告基因活性检测。结果表明,分离、克隆的NDVF、H基因序列全长分别为1662bp和1716bp,与模板pMD-F、pMD-HN基因序列100%同源；NDV假型病毒感染HEK293T细胞与相应的对照相比Luciferase活性值显著增高。成功构建了含Flag标签序列的NDV囊膜糖蛋白基因的真核表达质粒,制备出了NDV-F/HN假型病毒。