随着准分子激光角膜屈光手术的发展,角膜表面切削术因为不存在角膜瓣相关并发症,扩大了近视手术的矫治范围以及术后成像质量高等优势而重新受到关注。然而,角膜上皮下雾状混浊(Haze)的发生是制约角膜表面屈光手术的一个重要因素。Haze是准分子激光角膜表面切削术后一定时间在角膜切削区出现的上皮及其下方基质的雾状混浊,是准分子激光角膜表面切削术后的主要并发症之一。不同的角膜表面切削方式术后Haze的发生率也不同。Haze不仅影响视力,还是造成屈光回退的主要原因。Haze的形成是一个复杂的角膜创伤愈合反应过程,由多种细胞和因子参与调控,是多种因素共同作用的结果。近年来,角膜表面屈光手术后Haze形成的机制及防治已成为屈光手术研究的热点。本研究通过建立机械法准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术(Epi-LASIK)、去瓣的Epi-LASIK(off-flap Epi-LASIK)和准分子激光屈光性角膜切削术(PRK)动物模型,旨在从病理组织学角度和分子生物学水平,比较不同方式的准分子激光角膜表面切削术后角膜创伤的愈合反应和Haze产生的差异,来探讨Haze形成的机制,为临床上准分子激光治疗屈光不正的术式选择和Haze的防治提供理论依据。第一部分兔Epi-LASIK、去瓣的Epi-LASIK和PRK术后早期角膜创伤愈合反应的对比研究目的:通过比较兔Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三种角膜表面切削术,探讨不同的手术方式及术后不同的角膜上皮愈合方式对早期角膜创伤愈合反应的影响。方法:健康新西兰白兔共50只(100只眼),将其中48只(96只眼)随机分为Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三个手术组,每组32只眼,另2只兔(4只眼)未手术眼作为正常对照组。3%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉(1ml/kg体重)和0.5%爱尔卡因表面麻醉后,实验眼分别行Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三种角膜表面切削术,且每只兔的两只眼分别随机行不同的手术方式。Epi-LASIK术应用微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,准分子激光切削后再将上皮瓣复位,覆盖在切削区上;off-flap Epi-LASIK术是用微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,完成激光切削后,再将上皮瓣去除;PRK术用角膜上皮刮刀钝性机械去除角膜上皮,去除角膜上皮的直径为9.0mm,将上皮刮除干净后行激光切削。采用美国博士伦公司Technolas217型准分子激光治疗仪在实验眼均行-10.0D激光切削,切削深度120μm。分别在术后4小时、1天、3天和7天共四个时间点处死各组动物,取角膜进行如下实验观察:1.采用光镜、透射电子显微镜观察三种手术后角膜上皮的愈合方式。2.免疫组织化学方法检测角膜基质炎症细胞数量、角膜基质细胞凋亡数量以及白细胞介素-1(IL-1β)和增殖蛋白Ki-67在角膜基质的表达。结果:1我们通过光镜和透射电镜观察到三种手术术后角膜上皮的愈合方式有不同的特点:(1)Epi-LASIK术后4小时上皮大部分表层细胞水肿,有轻微损伤的表现,上皮与基质结合稍疏松;术后1天上皮瓣稍变薄,上皮表面微绒毛减少,小部分基底细胞水肿,提示上皮瓣活性尚可;术后3天可见上皮瓣水肿;术后7天上皮水肿消退,基本恢复正常结构,但上皮层数较前增多,约7-9层,上皮表面微绒毛正常。(2)off-flap Epi-LASIK术后4小时,角膜切削区基质表面无上皮;术后1天,有一层新生角膜上皮细胞覆盖切削区,以后新生的角膜上皮逐层增多,术后7天上皮层数约7-8层,结构恢复正常。(3)PRK组术后4小时,角膜切削区无上皮;术后1天,角膜切削区边缘可见单层上皮细胞向切削区延伸,切削区仍暴露部分裸露的基质床,以后新生的上皮逐渐覆盖切削区,层数增多,但上皮细胞排列较紊乱,术后7天,上皮约5-7层,上皮细胞排列稍紊乱,基底膜完整,上皮表面可见少量微绒毛。2角膜的愈合反应:(1)Epi-LASIKPRK、off-flap Epi-LASIK和PRK三种角膜表面切削术后4小时角膜浅基质层即可见炎性细胞浸润、凋亡的阳性细胞以及IL-1β和增殖蛋白Ki-67的表达;三组手术后1天角膜基质的炎性细胞数量和凋亡的细胞均最多,增殖蛋白Ki-67的表达均在术后3天达到高峰。(2)术后7天,Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK组未见炎性细胞,PRK组偶见炎性细胞,三组角膜基质中均仅有少量TUNEL阳性细胞,IL-1β和Ki-67的表达均开始降低。(3)PRK组术后4小时、1天、3天和7天四个时间点上述各项指标均显著高于Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK组,组间两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05);而Epi-LASIK组术后各时间点的炎性细胞数、凋亡的阳性细胞数以及IL-1β和增殖蛋白Ki-67的表达又均比off-flap Epi-LASIK组多,其中炎性细胞数和凋亡的阳性细胞数于术后1天和3天组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),IL-1β和Ki-67的表达在术后1天、3天和7天组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三种角膜表面切削术由于术中不同的上皮处理方式及术后不同的上皮愈合方式引起术后早期角膜创伤愈合反应程度的差异,其中off-flap Epi-LASIK的反应程度最轻,提示off-flap Epi-LASIK可能在减轻角膜表面切削术的术后早期刺激症状和远期Haze发生率方面具有一定的优势。第二部分兔Epi-LASIK、去瓣的Epi-LASIK和PRK术后Haze形成的对比研究目的:探讨Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三种角膜表面切削术后在Haze发生发展方面存在的差异及成因。方法:健康新西兰白兔共47只(94只眼),将其中45只(90只眼)随机分为Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三个手术组,每组30只眼,另2只兔(4只眼)未手术眼作为正常对照组。3%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉(1ml/kg体重)和0.5%爱尔卡因表面麻醉后,实验眼分别行Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三种角膜表面切削术,且每只兔的两只眼分别随机行不同的手术方式。Epi-LASIK术应用微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,准分子激光切削后再将上皮瓣复位,覆盖在切削区上;off-flap Epi-LASIK术是用微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,完成激光切削后,再将上皮瓣去除;PRK术用角膜上皮刮刀钝性机械去除角膜上皮,去除角膜上皮的直径为9.0mm,将上皮刮除干净后行激光切削。采用美国博士伦公司Technolas217型准分子激光治疗仪在实验眼均行-10.0D激光切削,切削深度120μm。三种角膜表面切削术后,进行如下实验观察:1、定期在裂隙灯显微镜下观察角膜上皮的愈合情况并记录每个手术组兔角膜上皮的愈合时间及进行Haze的分级评估。2、分别于术后1周、1个月和3个月共三个时间点处死各组动物,取角膜。通过透射电镜对兔术后不同时间点角膜的组织结构进行观察;采用免疫组织化学、免疫印迹法(Western Blot法)等检测方法测定与Haze形成密切相关的指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅲ型胶原在角膜中的表达。结果: 1角膜上皮愈合时间:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK术后兔眼平均角膜上皮愈合时间分别为4.1±1.0,3.8±0.8和4.4±1.2天,三个手术组组间两两比较差异均无统计学意义(F=0.88,P>0.05)。2角膜Haze情况:(1)术后1个月,Epi-LASIK组Haze的发生率为40%(0.5级Haze 6眼,1级Haze 2眼);off-flap Epi-LASIK组为35%(0.5级Haze 5眼,1级Haze 2眼);PRK组为80%(0.5级Haze 8眼,1级Haze 5眼)。PRK与Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK两组比较差异均有统计学意义(p<0.05);Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK两组间比较差异没有统计学意义(p>0.05)。(2)术后3个月,Epi-LASIK组Haze的发生率为30%(0.5级Haze 3眼);off-flap Epi-LASIK组为30%(0.5级Haze 2眼,1级Haze 1眼);PRK组为60%(0.5级Haze 4眼,1级Haze 2眼)。三组间两两比较差异均无统计学意义(p>0.05)。3、透射电子显微镜观察:(1)术后1个月,Epi-LASIK,off-flap Epi-LASIK和PRK三组角膜上皮的结构基本正常,角膜浅基质成纤维细胞明显增多、形态和排列不规则、细胞核变大、核仁明显、常染色质和粗面内质网丰富,新陈代谢旺盛,新生的胶原明显增多且排列紊乱。三组中PRK的程度较重,Epi-LASIK与off-flap Epi-LASIK两组比较未发现明显差异。(2)术后3个月,三个手术组角膜浅基质内成纤维细胞数量均开始减少、形态及排列较前规则,胶原排列仍稍紊乱,PRK组的程度比Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK两组稍重,且胶原纤维较粗大。4、免疫组织化学及免疫印迹法检测角膜中α-SMA的表达:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三组术后1周角膜中α-SMA的表达开始增多,术后1个月角膜α-SMA的表达均达到高峰。三组术后在1周、1个月和3个月角膜中α-SMA的表达均为PRK>Epi-LASIK> off-flap Epi-LASIK,三组与对照组以及三个时间点的组间两两比较差异均有统计学意义(p<0.05)。5、免疫组织化学及免疫印迹法检测角膜中Ⅲ型胶原的表达:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三组术后1周角膜中Ⅲ型胶原的表达明显增多,并均于术后1个月达到高峰,三组术后在1周、1个月和3个月角膜中Ⅲ型胶原的表达均为PRK>Epi-LASIK>off-flap Epi-LASIK,三组与对照组以及三个时间点的组间两两比较差异均有统计学意义(p<0.05)。结论:Epi-LASIK手术中上皮瓣的保留对促进术后角膜上皮的愈合、减少Haze形成没有明显的意义,角膜表面切削术中尽量减少对角膜上皮的损伤,是防治术后Haze形成的关键因素。off-flap Epi-LASIK与Epi-LASIK和PRK比较,术后角膜上皮愈合快、Haze反应轻,有望成为临床上优先选择的角膜表面屈光手术方式。第三部分兔Epi-LASIK、去瓣的Epi-LASIK和PRK术后角膜中TGF-β1和CTGF的表达及其对Haze形成的影响目的:通过观察Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三种角膜表面切削术后角膜中转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)的表达情况,探讨两者之间的关系及其对术后Haze发生发展的影响。方法:健康新西兰白兔共47只(94只眼),将其中45只(90只眼)随机分为Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三个手术组,每组30只眼,另2只兔(4只眼)未手术眼作为正常对照组。3%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉(1ml/kg体重)和0.5%爱尔卡因表面麻醉后,实验眼分别行Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三种角膜表面切削术,且每只兔的两只眼分别随机行不同的手术方式。采用美国博士伦公司Technolas217型准分子激光治疗仪在实验眼均行-10.0D激光切削,切削深度120μm。分别于术后1周、1个月和3个月共三个时间点处死各组动物取角膜,采用免疫组织化学和免疫印迹法(Western Blot法)检测Haze形成过程中的两个主要调控因子TGF-β1和CTGF在三种手术后角膜中的表达情况。结果:1免疫组织化学及免疫印迹法检测角膜中TGF-β1的表达:正常对照组角膜中TGF-β1的表达非常低弱。Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK术后1周TGF-β1的表达明显增强,术后1个月达高峰,术后3个月仍有较强表达,其中PRK组在术后1周、1个月和3个月三个时间点TGF-β1的表达均明显高于Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK组,Epi-LASIK组又稍高于off-flap Epi-LASIK组,三组与对照组以及三个时间点的组间两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。2免疫组织化学及免疫印迹法检测角膜中CTGF的表达:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK术后1周CTGF的表达开始升高,均在术后1个月表达最强,术后3个月仍有较高表达,其中PRK组在术后1周、1个月和3个月三个时间点CTGF的表达均明显高于Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK组,差异均具有统计学意义(P<0.05);Epi-LASIK组在术后三个时间点CTGF的表达又稍高于off-flap Epi-LASIK组,术后1周两组比较差异无统计学意义(P>0.05),术后1个月、3个月比较差异具有统计学意义(P<0.05);三组与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β1和CTGF介导了角膜表面切削术后角膜创伤的愈合反应,在愈合反应过程中具有协同作用,与Haze的发生发展关系密切。off-flap Epi-LASIK术后各时间点角膜中TGF-β1和CTGF的表达明显低于Epi-LASIK和PRK,差异均具有统计学意义(P<0.05),提示off-flap Epi-LASIK在减少术后Haze形成方面较Epi-LASIK,特别是PRK具有明显优势。