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实验目的：通过对人生长激素(human growth hormone, hGH)分子上的受体(hGI R)结合位点1(S1)或2(S2),或两者实施单或双氨基酸定点突变,观察S1、S2或两者与受体的亲和力的增加能否提高hGH的生物学效应；并通过检测1:2 hGH-hGHR三聚复合物的形成数量,探讨hGH亲和力与生物学效应之间的关系,以寻求提高hGH生物学效能的规律。实验方法：1.hGH突变体(hGHmut)的制备与筛选综合文献报道,在hGH S1和S2中选择了9个可能影响亲和力的氨基酸位点,并采用PCR一步法定点诱变对野生型hGH (hGH-WT)进行单或双氨基酸定点突变。将测序鉴定后的hGHmut-pET20b(+) 或 hGHBPmut-pET20b(+)重组子转化至感受态细胞TransettaDE3,表达目的蛋白并进行蛋白提取和纯化。采用SDS-PAGE和紫外分光光度计对各hGHmut蛋白进行纯度、浓度和分子量鉴定。最后应用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance, SPR),通过BIAcore T-200检测各hGHmut的S1和S2与hGH受体的亲和力以及结合动力学变化。2. hGHmut的生物学效应的检测 以hGH-WT为对照,体外采用细胞活力实验检测不同hGHmut的促细胞增殖能力。体内通过对垂体GH缺乏的遗传性Lewis侏儒大鼠补充不同的hGHmut (剂量为0.5mg/kg,每日注射1次,持续注射2周),隔日称重,以hGH-WT为对照,比较动物体重增长速度；于最后一次注射3小时后,断头取血、肝,并分离胫骨比较其增长速度。采用Elisa检测血清IGF-1的浓度；采用实时荧光定量PCR检测侏儒大鼠的肝脏GHR、IGF-1基因的表达。最后,进一步采用雄、雌两组侏儒大鼠检测高效能突变体的体内促生长效应是否具有性别差异。3. hGHmut的动力学和亲和力与生物学效能的关系的分析 采用三分子SPR技术检测1:2 hGH-hGHBP三聚复合物的结合响应值,据此分析不同hGHmut的三聚复合物的形成数量；将hGHmut三聚复合物的形成数量与生物学效能之间的进行相关性分析；最后,对hGHmut的动力学与三聚复合物形成数量的关系进行分析。实验结果：1.hGHmut的鉴定及亲和力变化分析经测序鉴定出4个S1突变体,4个S2突变体和4个S1+S2联合突变体的序列与实验设计完全一致。各突变体蛋白表达纯化后,经S DS-PAGE电泳鉴定其分子量与WT一致,均为22kDa,纯度达90%以上；紫外分光光度计测定显示,hGH-WT和12个hGHmut重组蛋白的OD260/280nm均小于0.65,浓度均大于2mg/ml。采用SPR技术我们筛选出了3个S1亲和力提高的单突变体(R167XS1、 E174AS1 R64K/F54PS1)和1个S2亲和力提高的单突变体(N109XS2);其余4个单突变体均表现为Sl或S2亲和力降低；将上述S1和S2亲和力分别提高的单突变体进行联合突变后,获得了S1和S2亲和力同时显著提高的联合突变体(R167X/N109XS1/S2、E174A/N109XS1/S2)。对突变体进行动力学分析显示,高亲和力的突变体有两种不同的结合模式：第一种(如R167Xs1和E174As1)是既提高了激素-受体的结合速率(kon),又降低了激素-受体的解离速率(koff)；第二种(女口N109XS2、R64K/F54PS1是只降低了koff,而kon不变甚至轻微降低(此时kon轻微降低对亲和力的影响被大幅降低的koff抵消)。2. hGHmut生物学效能的变化 离体细胞增殖实验和在体侏儒大鼠增重实验显示：①不论是单突变位点还是联合突变位点,S1或S2亲和力降低的hGHmut,生物学效能均显著降低；②S1亲和力提高的单突变体,若S2亲和力维持正常,呈现一定程度的促细胞增殖效应,但在的体增重效能并未提高；③单独提高S2亲和力的突变体未显示生物学效能增加。④S1和S2亲和力同时提高的联合突变体表现出显著的体外促细胞增殖和体内促增重效应增强,且体内效应无性别差异。在体实验还发现,S1和S2亲和力同时提高的联合突变体能显著提高血清IGF-1的水平以及肝脏GHR和IGF-1基因的表达,提示其生物学效应的提高与GH-IGF-1轴的放大作用有关。3. hGHmut的生物学效能与1:2 hGH-hGHBP三聚复合物形成数量的关系对hGHmut的三聚复合物的结合响应值与生物学效能进行相关性分析显示：三聚复合物的结合响应值与细胞增殖ECs0值高度负相关(r=-0.98,p<0.001),与侏儒大鼠体重增长百分比高度正相关(r=+0.89,p<0.01))。其中,S2亲和力提高(对S1无影响)的突变体,由于1：1hGH-hGHR二聚复合物的基数未变,三聚复合物的结合响应值无变化(如N109XS2)。而S1亲和力提高(对S2无影响)可一定程度的提高结合响应值(如R167XS1、E174AS1)；同时提高S1和S2亲和力的突变体其三聚复合物结合响应值最高(如R167X/N109XS1/S2、 E174A/N109XS1/S2)。4. hGHmut的动力学与三聚复合物形成数量的关系 S1或Sl+S2亲和力提高且动力学结合模式为既有kon提高又有koff降低的突变体(如R167XS1、 E174AS1、R167X/N109XS1/S2、E174A/N109XS1/S2)其三聚复合物的结合响应值提高,其中S1+S2联合突变体的响应值比S1单突变体更高。其它亲和力提高(不论是S1还是S2)的突变体,如果是单纯koff降低所致,都不能提高三聚复合物的结合响应值。结论：1. hGH S1或S2的亲和力降低,均使三聚复合物形成数量下降,生物学效能显著降低；单独提高Sl的亲和力时,只要S2亲和力仍维持正常,可表现出一定程度的体外促细胞增殖效应,但不能被体内实验证实。提示S1和S2的亲和力对hGH生物学效能影响是敏感的,并未处于“过饱和”状态。2.单独提高S2的亲和力时,由于1:1 hGH-hGHR二聚复合物的基数未变,不能提高三聚复合物形成数量,无论在体外还是在体内,均未显示生物学效能增加。这提示：相对于S2,S1的亲和力对hGH生物学效应的影响占主导。3. 同时提高S1和S2亲和力与单独提高S1亲和力比较,前者与受体作用时能产生更多的12 hGH-hGHBP三聚复合物,并在体外和体内均显示出增强的促生长效应； 其体内效应的增强与肝GHR表达上调及GH-IGF-1轴系统的放大效应有关。