艾滋病，又名获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是一种由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的传染性疾病。该病传播迅速，死亡率极高，被称为“二十世纪瘟疫"。研制安全且有效的疫苗对于控制艾滋病的传播非常重要。在过去，人们曾一度认为，诱导机体产生针对HIV包膜蛋白的体液免疫应答是艾滋病疫苗研制的主要方向。然而由于病毒的逃逸作用，疫苗诱导的中和抗体被证实难以有效的完全防御HIV的入侵。科学家们发现，艾滋病病原体的gag基因及所编码蛋白在序列上相对比较保守，是疫苗研制的理想标靶。临床研究指出，在HIV感染者中有一群长期感染但无发病的个体，他们体内存在着相对高水平的Gag-特异性CTL应答。另一些研究表明，针对Gag-p17的CTL应答与患者病毒载量呈负相关。以上发现提示了针对艾滋病病毒Gag抗原的疫苗能够增强机体的保护性免疫反应。目前，世界不同国家针对gag基因及其编码产物已经开发出许多相应的疫苗候选物，其有效性以及安全性尚在实验研究阶段。在所有疫苗候选物中，DNA疫苗是研究的一大热点，被称为“疫苗的第三次革命”。研究证实，DNA疫苗能够在多种动物体内同时诱导体液免疫与细胞免疫应答，给HIV感染的防治带来了益处。 为了研究HIV gag DNA疫苗诱导抗原特异性的细胞免疫应答的产生与维持，本实验室利用分子生物学技术构建出HIV gag DNA疫苗，其核心序列为HIV(HXBc2病毒株)的gag完整序列片断。我们采用C57BL/6小鼠为实验模型，以肌肉注射法对其进行HIV gag DNA疫苗免疫，分别于不同时间点后获取脾与肺组织的单个细胞，在体外对其加入Gag抗原多肽刺激后，采用ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的水平，ELISPOT法检测IFN-γ分泌细胞的频率，流式细胞仪分析不同的特异性T细胞亚群及表型。结果显示：末次免疫1周后，经Gag多肽刺激的加强免疫组小鼠脾内及肺组织内IFN-γ产生的总体水平和分泌细胞频率均高于对照组及初次免疫组(P<0.05)，表明了加强免疫HIVgagDNA疫苗比初次免疫更能诱导小鼠产生抗原特异性的细胞免疫效应。而且该效应同时存在于淋巴组织(脾)与非淋巴组织(肺)之中。运用流式细胞仪技术，我们又发现，HIVgagDNA疫苗能同时诱导CD4<+>和CD8<+>两群T细胞产生应答。疫苗学的基础在于提供长期、有效的免疫记忆。为了探讨HIV gag DNA疫苗诱导的特异性细胞免疫记忆应答，我们在末次免疫5周后，对抗原特异性IFN-γ做了进一步的检测：经多肽刺激后，加强免疫组IFN-γ的总体产生水平和分泌细胞频率同样均高于对照组及初次免疫组(P<0.05)。无论从总体水平还是从单细胞水平检测的结果表明，小鼠加强免疫HIV gag DNA疫苗后其淋巴器官(脾)与非淋巴器官(肺)内均存在有应答功能的记忆性T细胞。证明了加强免疫疫苗与初次免疫相比，在诱导出更明显的细胞免疫效应的同时也保持了更高水平的细胞免疫记忆。这些发现提示我们在利用HIV gag DNA疫苗进行免疫时选择“初免+加强”方式的必要性。 流式细胞技术分析得出，加强免疫组淋巴器官与非淋巴器官内均存在CD4<+>和CD8<+>两群抗原特异性记忆性T细胞，其中抗原特异性CD8<+>记忆性T细胞所占的比例高于CD4<+>记忆性T细胞，在非淋巴器官中的分布尤为显著。最近的研究指出，记忆性T细胞表达CD127对于其长期存活具有十分重要的意义。本实验中，疫苗诱导Gag-特异性记忆T细胞的主要表型为CD62L<->CD127<+>，属于效应型记忆T细胞，它们在免疫应答的晚期主要存在于非淋巴器官，提供迅速的保护作用。 不同抗原特异性的免疫记忆在体内维持的时间长短不一。实验结果表明，HIVgagDNA疫苗诱导的Gag抗原特异性T细胞免疫记忆至少可以维持16周。如何延长疫苗诱导免疫记忆的维持时间，有赖于进一步的研究。 理想的艾滋病疫苗不但要在人体内诱导足够强的细胞免疫应答，同时也要诱导出体液免疫应答，才能从不同途径阻止HIV在体内复制。为了全面评价HIV gagDNA疫苗的作用，我们还利用间接ELISA技术对不同免疫组小鼠的血清进行了抗原特异性抗体IgG的检测。末次免疫1周及5周后的ELISA结果提示，与初次免疫相比，加强免疫HIV gag DNA疫苗能诱导小鼠产生更高水平、个体差异更小的Gag-特异性IgG，进一步巩固了我们对“初免+加强"免疫方式的信心。通过对不同时间点实验结果的分析，我们发现，加强免疫HIV gag DNA疫苗诱导的体液免疫应答可以长期维持。至少在末次免疫后的16周，抗原特异性的IgG依然保持在高水平。疫苗诱导的抗原特异性IgG<,1>/IgG<,2a>的比率随着时间延长呈下降趋势，与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.01)，提示疫苗能促进IgG同种型的转换。综上所述，本文从多角度探讨了HIV gag DNA疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫与体液免疫应答，为该疫苗在灵长类动物及人类体内的深入研究提供了实验依据。