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本研究通过体外扩增MTB esat6、lhp及lhp-esat6融合基因，构建原核表达载体并在E.coli中表达，然后鉴定、分离及纯化重组蛋白。用动物试验和临床病例评价rCFP10-ESAT6融合蛋白在MTB感染免疫学诊断中的价值。第一部分 结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建及表达 目的：构建MTB esat6基因原核表达质粒，在E.coli中表达并用亲合层析法纯化rESAT6蛋白。方法：以一对分别带有HindⅢ和BamHI酶切位点的引物，以MTB基因组为模板，用PCR法扩增MTB esat6基因，并将其克隆入pQE30质粒。测序正确后，再亚克隆入pET32a(+)质粒，构建pQE30-ESAT6和pET32a(+)-ESAT6重组体。用重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌，在IPTG诱导下进行表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定，再经Ni-NTA柱纯化，并用活动性结核患者血清以Western-blot法鉴定其抗原性。结果：成功构建pQE30-ESAT6和pET32a(+)-ESAT6重组质粒，但pQE30-ESAT6在DH5α菌中未表达目的蛋白，而pET32a(+)-ESAT6在BL21（DE3）菌中高效表达了分子量为32kDa左右的rESAT6蛋白。IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在<WP=11>于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42%，经过Ni-NTA柱纯化，获得了纯度为92%的重组蛋白。Western blot证实rESAT6可以与活动性结核患者血清发生特异性结合反应。结论：成功构建原核表达载体pET32a(+)-ESAT6，并获得纯化rESAT6蛋白。第二部分 结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建及表达目的：构建MTB lhp基因原核表达质粒，在E.coli中表达并用亲合层析法纯化rCFP10蛋白。方法：以一对分别带有HindⅢ和BamHI酶切位点的引物，以MTB基因组为模板，用PCR法扩增MTB lhp基因，并将其克隆入pQE30质粒。测序正确后，再亚克隆入pET32a(+)质粒，构建pQE30-CFP10和pET32a(+)-CFP10重组体。用重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌，在IPTG诱导下进行表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定，再经Ni-NTA柱纯化，并用活动性结核患者血清以Western-blot法鉴定其抗原性。结果：成功构建pQE30-CFP10和pET32a(+)-CFP10重组质粒，但pQE30-CFP10在DH5α菌中未表达目的蛋白，而pET32a(+)-CFP10在BL21（DE3）菌中高效表达了分子量为32kDa左右的rCFP10蛋白。IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的38%，经过Ni-NTA柱纯化，获得了纯度为93%的重组蛋白。Western blot证实rCFP10可以与活动性结核患者血清发生特异性结合反应。结论：成功地构建原核表达载体pET32a(+)-CFP10，并获得纯化rCFP10蛋白。<WP=12>第三部分 结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建及表达目的：构建MTB lhp-esat6融合基因及其原核表达质粒，在E.coli中诱导表达，并用亲合层析法纯化rCFP10-ESAT6融合蛋白。方法：用Gene SOEing法，通过3次PCR，将lhp基因和esat6基因通过一Linker体外重组，构建lhp-esat融合基因，并将其克隆入pQE30质粒构建pQE30-CFP10-ESAT6重组体。将该重组体转化入DH5α菌，并在IPTG诱导下进行表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定，再经Ni-NTA柱纯化，并用活动性结核患者血清、兔抗CFP10血清及兔抗ESAT6血清以Western-blot法鉴定其抗原性。结果：成功构建lhp-esat6融合基因及pQE30-CFP10-ESAT6质粒，并在DH5α菌中高效表达出26kDa左右的rCFP10-ESAT6融合蛋白。IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的40%，经过Ni-NTA柱纯化，获得了纯度为98%的重组蛋白。Western blot证实其兼具CFP10和ESAT6蛋白的抗原性。结论：成功构建MTB lhp-esat6融合基因，成功构建原核表达质粒pQE30-CFP10-ESAT6，并获得纯化rCFP10-ESAT6融合蛋白。 第四部分 重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在豚鼠感染模型的应用 目的：建立豚鼠MTB感染模型和BCG免疫模型；以rCFP10-ESAT6<WP=13>融合蛋白为抗原用皮试法和ELISA法评价其对豚鼠MTB感染和BCG免疫的鉴别诊断意义。 方法：分别用H37Rv活菌和BCG活菌致敏豚鼠，4周后用不同剂量的重组融合蛋白对同一只豚鼠作皮试，同时设立5IU PPD阳性对照及NS阴性对照，于注射后24h、48h、72h测量红肿或硬结的直径(mm)。建立以重组融合蛋白及PPD为包被抗原的ELISA法，检测每组豚鼠血清中的结核菌抗体。结果：以重组融合蛋白为抗原的皮肤试验诊断MTB感染豚鼠的特异性和敏感性分别为100%(21/21)、90.9%(10/11)，以PPD为抗原的皮肤试验诊断MTB感染豚鼠的特异性和敏感性分别为47.62%(10/21)、90.9%(10/11)；重组融合蛋白引起的DTH反应中，以1.0μg剂量效果最好，观察时间以皮试后24小时效果最好，1.0μg重组融合蛋白在MTB感染豚鼠上引发的红肿、硬结比5IU PPD引发的红肿、硬结大。在ELISA试验中，以10只NS对照豚鼠OD490+2s为正常界限值，重组融合蛋白诊断H37Rv感染豚鼠的特异性和敏感性分别为95.24%（20/21）、100%（11/11），PPD诊断H37Rv感染豚鼠的特异性和敏感性分别为47.62%（10/21）、100%（11/11），以重组融合蛋白为抗原的阳性值