茶树WRKY基因家族鉴定及功能分析

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茶树是一类重要的经济作物,但其在生长过程中会遭遇多种病虫危害和非生物胁迫,这些逆境严重影响了茶树的生长发育和经济效益。WRKY转录因子和VQ基序蛋白在植物的生长发育和调控逆境防御机制方面具有重要的作用。本文从‘龙井43’中鉴定了9个WRKY转录因子和15个VQ基序蛋白,研究了它们响应不同逆境的表达模式,并分析了‘舒茶早’基因组数据库中WRKY转录因子和VQ基序蛋白家族成员的数量以及相互作用。通过模式植物—拟南芥和烟草,验证了与生长发育和抗逆密切相关的CsWRKYs基因功能,以期为茶树CsWRKYs转录因子和Cs VQs基序蛋白在茶树生长发育和抗逆性方面的分子机制提供理论依据。主要研究结果如下:(1)挖掘茶树中潜在的CsWRKYs基因并分析了它们的表达特性。利用生物信息学手段和RT-PCR技术获得了9个CsWRKYs基因,同时预测了它们编码蛋白的相对分子质量、理论等电点、跨膜结构域和信号肽。组织表达特性分析显示,大部分CsWRKYs在花和茎中的表达变化低于其他组织,在叶中具有较高的表达水平。不同逆境处理下,9个CsWRKYs基因在茶树根和叶中的表达变化不同,但大部分基因在叶片中的表达水平都被诱导上调。结果表明茶树CsWRKYs转录因子参与茶树生长发育并响应逆境胁迫。(2)从茶树中挖掘出15个VQ基序蛋白,分别属于第I、II、V、VI、VIII、IX、X亚组,每个亚组分别包含3、3、1、3、1、2、2个成员。它们在不同组织中的表达特性与WRKY基因相似,即大部分基因在叶中具有较高的转录水平;不同逆境处理的叶片中,大部分Cs VQ基因具有较高的表达水平,而在根中则呈现出相反的表达模式。这些结果表明Cs VQ基序蛋白在茶树生长发育过程和逆境胁迫应答中发挥着重要的作用。(3)从‘舒茶早’基因组数据库中筛选到74个WRKY转录因子和30个VQ基序蛋白,综合分析得出茶树CsWRKYs转录因子的WRKY保守域至少含有三种变异—WRKYGQK、WRKYGKK及WRKYGRK,Cs VQ基序蛋白至少含有四种类型VQ基序—LTG、FTG、VTG及VTA。利用STRING在线网站,以拟南芥为模型,在茶树中预测得到13对潜在的WRKY-VQ互作蛋白。大多数互作的蛋白都具有相似的组织表达模式,如CsWRKY26/Cs VQ4、CsWRKY26/Cs VQ9和CsWRKY57/Cs VQ23-1。(4)CsWRKY26抗逆胁迫功能鉴定。CsWRKY26转录因子定位在细胞核,酵母双杂实验表明CsWRKY26基因C端序列(位于第209-470位氨基酸)可以与Cs VQ4-1/9-1/15/21/23-1蛋白存在相互作用。非生物胁迫(Na Cl和PEG)和自然干旱可显著诱导CsWRKY26基因表达水平。ABA、Me JA、6-BA以及生长素类激素—IAA、NAA和2,4-D也可以显著诱导CsWRKY26基因的相对表达水平。CsWRKY26基因的启动子区域含有多个光照、生长发育和MBS、W-box等逆境相关的顺式元件,GUS组织化学染色与CsWRKY26基因的组织表达特异性相似。相对野生型株系而言,CsWRKY26转基因拟南芥的种子在萌发期对ABA不敏感,对Na Cl引起的盐胁迫以及聚乙二醇和甘露醇引起的渗透胁迫具有一定的抗性,且在幼苗生长期对外源ABA和PEG诱导具有一定的抗性。在PEG模拟的干旱条件下,胁迫相关基因如RD22、脯氨酸合成的关键基因P5CS1以及ABA合成的关键限速酶NCED3表达量都上调。自然干旱条件下,过表达CsWRKY26转基因植株的生长状态优于野生型,转基因株系电导率显著降低,脯氨酸含量升高。RNA-seq分析发现,自然干旱下,超表达株系中有1700个差异表达基因(DEGs),其中包含559个特异上调和428个特异下调表达基因,在上调的DEGs中,有2个参与糖代谢的基因(SWEET16、Sucrose synthase 5),多种转录因子b HLH(b HLH30/-71/-72/-93/-137)、MYB(MYB24/-29)、ERF类转录因子(ERF008/-010/-034/-042),此外还包含多个生长素响应蛋白如IAA27/-29、逆境响应基因RD22等,因此结合相关生理指标,推测过表达CsWRKY26基因在干旱条件下可通过降低细胞膜的受损程度、积累渗透物质的含量、增强部分胁迫反应基因的表达、激活依赖和独立于ABA或其他信号传导途径如乙烯、生长素及MAPK的相关基因的转录水平,最终提高转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受性。(5)初步探究茶树CsWRKY7和CsWRKY12转录因子的功能。CsWRKY7和CsWRKY12转录因子都定位在细胞核中。利用PCR技术,以‘龙井43’叶片的基因组DNA为模板,分别获得CsWRKY7和CsWRKY12基因上游1680 bp和1835 bp的启动子序列,分析表明它们的启动子区域包含多个光照、生长发育和逆境胁迫相关的顺式作用元件。利用叶盘法和蘸花法获得了超表达CsWRKY7和CsWRKY12基因的烟草和拟南芥植株,为后续试验提供了材料。相对野生型株系,超表达CsWRKY7的拟南芥株系在种子萌发期和幼苗生长期对Na Cl引起的盐胁迫、甘露醇和PEG 6000引起的渗透胁迫以及低浓度ABA诱导不敏感。在正常生长条件下,CsWRKY7促进拟南芥营养生长,延迟花期。基因表达分析实验表明,成花素FLOWERING LOCUS T(FT)、两个花分生组织基因—APETALA1(AP1)和LEAFY(LFY)在CsWRKY7过表达的株系中的相对表达水平都低于野生型,表明CsWRKY7转录因子可能参与调控AP1和LFY基因的转录水平。超表达CsWRKY12的拟南芥植株和wrky12突变体的回复株系都呈现早花型,尤其是短日照下的表型更显著。在短日照下,超表达株系中茎生叶数目多于野生型拟南芥,其中茎长度均显著高于野生型;回复株系中,茎生叶数、茎长度和角果数均回复wrky12的表型且开花表型更明显。利用荧光定量PCR分析了短日照下相关开花途径基因的表达模式,其中LFY、FT和AP1的相对转录水平有不同程度的升高,表明CsWRKY12基因直接或间接调控LFY、FT和AP1基因的转录水平,从而参与拟南芥开花的生理进程。
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