原肠胚期三胚层胚盘头端及两侧的半月形生心中胚层构成第一生心区,形成的原始心管仅为左心室原基。位于原始心管头端和背侧的脏壁中胚层间充质构成第二生心区,不断向心管添加心肌细胞,形成流出道、右心室、部分心房等结构,但第一生心区和第二生心区在胚胎发生过程中的形态学关系,所见报道较少。心肌前体细胞向心肌细胞的分化以及正常心形态发生受多种信号系统及转录因子的调节,其中转录因子ISL-1是第二生心区心肌前体细胞较好的标记蛋白,GATA4与NKx2.5是心肌前体细胞和心肌细胞较好的标记蛋白,调控第一和第二生心区心肌前体细胞的增生及向心肌细胞的分化。GATA4、Nkx2.5和ISL-1基因突变或基因敲除引发先天性心脏畸形或胚胎死亡。第一、第二生心区心肌前体细胞向心肌细胞的分化及心的正常形态发生需内胚层的诱导。在发育早期去除内胚层,不能形成正常搏动的心管。有关前肠内胚层对心管发育的诱导作用主要集中在对多种信号分子和转录因子的研究,条件性敲除前肠内胚层的一些信号分子或转录因子基因,小鼠胚胎流出道、右心室及弓动脉发育畸形,因此认为,前肠内胚层通过不同的分泌信号分子或转录因子作用于心肌前体细胞,诱导心肌细胞分化和心的形态发生。有关前肠内胚层发育与心脏发育关系的研究主要限于对两栖类、鸡胚的体外观察及对敲除内胚层相关基因小鼠的观察,对正常小鼠前肠内胚层在诱导胚胎心肌细胞分化和心发生过程中的形态学变化,以及在心形态发生过程中与第一、第二生心区发育的相互形态学关系的研究未见报道。本研究探讨了第一生心区和第二生心区在胚胎发生过程中的形态学关系,以及前肠内胚层发育对小鼠胚胎心流出道的发生与分隔的影响,为阐明前肠内胚层诱导心正常发育的理论提供形态学依据,也为进一步探讨由于流出道分隔异常而导致的动脉十永存等先天畸形发生机制的胚胎学起源提供一定的形态和理论基础。对GATA4在心早期发育过程中的研究,主要集中在对体外培养或敲基因、转基因小鼠的表型观察及mRNA水平,且缺乏系统的报道,对GATA4蛋白在胚胎早期动脉端发育过程中时空表达规律以及与Nkx2.5表达的关系也缺乏系统观察。GATA4可促进前肠内胚层细胞的生长,前肠内胚层可诱导第一、第二生心区心肌前体细胞的分化和心的正常发育,对正常小鼠GATA4蛋白在前肠内胚层的时空表达特点及GATA4阳性内胚层与心早期发育的形态学关系尚未见报道。本研究应用免疫组织化学结合Western blotting方法,观察了GATA4在小鼠胚胎生心区及前肠内胚层的时空表达特点,探讨了GATA4的表达与心动脉端发育、分隔的关系,为进一步阐明前肠内胚层诱导心正常发育的理论提供形态学依据。本实验第一部分应用免疫组织化学及免疫荧光方法,结合转录因子胰岛素增强子结合蛋白(Islet-1,ISL-1)、Nkx2.5、α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、心肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在心肌分化过程中的表达特点,研究了前肠呼吸内胚层的发育与小鼠胚胎心流出道的形态发生关系。第二部分,应用免疫组织化学、免疫荧光和Western Blotting方法,结合GATA4、Nkx2.5、ISL-1,α-SMA和MHC在小鼠胚胎第一生心区、第二生心区及前肠内胚层的时空表达特点,以及GATA4和磷酸化组蛋白H3(PHH3)在胚龄11～14天小鼠胚胎心的表达,探讨了转录因子GATA4在生心区及前肠内胚层的表达与小鼠胚胎动脉端发育的形态学关系。第一部分小鼠胚胎心流出道的形态发生与呼吸内胚层发育偶联用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗转录因子胰岛素增强子结合蛋白(ISL-1)、抗Nkx2.5及抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体对胚龄7.5～13天小鼠胚胎心连续切片进行免疫组织化学PAP法或免疫荧光染色。结果显示：胚胎发育7.5天,ISL-1表达于生心板心肌前体细胞和体壁中胚层。随胚盘侧褶形成,ISL-1阳性表达山生心板向胚内体腔内侧壁及前肠两侧间充质扩展,发育为心包腔背侧壁及咽两侧ISL-1阳性的第二生心区间充质,并保持较高的增生活性。胚龄9-10天,MHC表达阳性的心肌延伸至流出道与心背系膜的返折处,与ISL-1、NKx2.5表达重叠。胚胎发育11天后,ISL-1和α-SMA阳性表达的流出道远端,失去MHC表达。11天后,前肠腹侧ISL-1阳性锥体形结构的头端、尾端分别延伸至动脉囊头尾侧壁,并伸入动脉囊腔。在胚胎发育12～13天,锥体形结构的IS1-1阳性心肌前体细胞迁移至心包内升主动脉和肺动脉十壁及主肺动脉隔之间。胚胎发育第10天始,ISL-1强阳性的前肠腹侧呼吸内胚层紧邻动脉囊背侧壁内皮,局部增厚,形成突向动脉囊腔的内胚层突起。发育至11天后,前肠腹侧份ISL-1阳性内胚层增生活跃,上皮细胞层数明显增加,并向动脉囊方向生长,形成实心内胚层细胞索。围绕增生的前肠腹侧呼吸内胚层及内胚层细胞索,ISL-1阳性间充质细胞聚集,形成特征性ISL-1阳性锥体形结构。随发育,内胚层细胞索伸长,ISL-1阳性锥体形结构的尖端逐渐生长入动脉囊腔,并与流出道心内膜垫融合,将流出道远端分隔为心包内升主动脉和肺动脉干。胚龄11天,有些部位增厚的内胚层出现细胞排列不规则,细胞间隙明显,细胞分散,细胞大小不等,呈现间充质细胞样形态,与周围1SL-1阳性间充质细胞无明确界限。因此,我们认为：ISL-1同时是第一、第二生心区心肌前体细胞的标记蛋白。第一生心区和第二生心区是连续结构,原始心管的形成与第二生心区向发育中心管添加心肌细胞是连续的发育过程。第二生心区ISL-1阳性细胞于胚龄10天前,向心肌细胞分化,11天后,向动脉囊壁平滑肌方向分化。胚龄11天后,前肠腹侧ISL-1阳性锥体形结构参与动脉囊壁、主肺动脉隔及心包内升主动脉干和肺动脉干壁的形成。胚龄10天始,前肠腹侧呼吸内胚层细胞的增生和细胞索的形成可能诱导第二生心区的扩展,形成特征性ISL-1阳性锥体形结构。前肠腹侧呼吸内胚层细胞在增生过程中失去极性,可能通过上皮—间充质转化,形成ISL-1阳性锥体形结构中的间充质细胞,保持第二生心区细胞数量稳定,流出道的分隔和前肠呼吸内胚层的发育密切相关。第二部分转录因子GATA4的表达与小鼠胚胎心动脉端的发育用抗GATA4、抗Nkx2.5、抗转录因子胰岛素增强子结合蛋白(ISL-1)、抗α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体对胚龄7.5～13天小鼠胚胎心脏连续切片进行免疫组织化学PAP法或免疫荧光染色。Western Blotting检测GATA4与磷酸化组蛋白H3(PHH3)在胚龄11～14天小鼠胚胎心的表达。结果显示：GATA4和Nkx2.5蛋白在小鼠胚胎7.5天同时表达于生心板,早于MHC的表达,胚龄8.5～10天,GATA4和Nkx2.5进一步表达于心包腔背侧壁第二生心区的脏壁中胚层,胚龄11天～13天,两者的表达从流出道与心包腔背侧壁交界处降至主肺动脉根部,流出道心内膜(垫)间充质中可见GATA4阳性细胞。胚龄11～13天,GATA4见于前肠内胚层,ISL-1阳性间充质细胞围绕前肠腹侧GATA4阳性的呼吸内胚层及内胚层细胞索分布,可见少量GATA4阳性细胞延伸至前肠内胚层周围的间充质中。GATA4与磷酸化组蛋白H3(PHH3)的表达高峰见于胚龄11～13天,胚龄14天GATA4与PHH3显著减少。因此,我们认为：小鼠胚胎发育早期,GATA4与Nkx2.5在生心区的表达模式相同,GATA4可能促进心肌细胞增生,前肠内胚层的GATA4可能参与第二生心区的发育。GATA4在小鼠胚胎心发育过程中有独特的时空分布,GATA4在生心区的表达与心早期发育密切相关,在前肠内胚层的表达与第二生心区发育及流出道分隔密切相关。