研究背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染呈世界性分布,尽管乙肝疫苗已经普及了20年,但全球仍有20亿人感染过HBV,其中2.4亿为慢性感染。我国的慢性HBV感染者有9300万,其中2000万是慢性乙型肝炎患者。治疗慢性乙型肝炎最重要的手段是控制HBV复制,以减轻和延缓病情的发展。目前主要有两大类抗病毒药物：干扰素和核苷(酸)类似物。由于核苷(酸)类似物服用方便,作用效果强、不良反应少,已被越来越多的慢性乙型肝炎患者所接受。但在长期抗病毒治疗的同时,HBV会在药物的压力下获得适应性变异,产生耐药病毒株,导致治疗的失败。临床上轻则引起患者病情的进展,重则诱发肝硬化、肝衰竭等。因此耐药相关的研究已受到越来越多学者的关注。关于核苷(酸)类似物耐药的位点大多都集中在HBV逆转录酶(reverse transcriptase, RT)区的A至D结构域内。研究表明,目前能引起HBV耐药的5条通路中有2条通路都和B结构域rtA181T/V变异相关,这是一个交叉核苷和核苷酸两大类药物的交叉耐药位点,对目前几乎所有核苷(酸)类似物均呈现一定的耐药性。对rtA181T/V变异的研究有着深刻的意义。HBV基因组是短小而高效精干的,其中67%的基因组重叠编码,一段序列可重复编码1.5次。逆转录酶区的突变同样可以导致表面抗原S区编码氨基酸的改变。rtA181T变异后可引起S区氨基酸提前产生终止密码子,而使表面抗原截短；rtA181V变异后可引起表面抗原出现氨基酸的置换,那么这种对表面抗原的影响差异在临床上和实验室中是否一致?HBV在复制和传播中同时受到宿主免疫和药物压力的影响。除了核苷(酸)类似物的耐药主要发生在RT区,rtA181T/V变异病毒株的C区变异情况又如何呢?随着临床可选核苷(酸)类似物的增加,耐药变异的形式也呈现多样化、复杂化。不同的多药耐药位点出现是临床所面临的新挑战,有很多针对这方面的研究,但大多是对直接测序的结果而展开。这样并不能分清不同的变异位点在同一株病毒上,还是不同的病毒株之间,因此有必要对其采用克隆后测序的方法,对宿主体内病毒准种进行详尽的分析,了解病毒的变异特点。基因型可能影响病情发展和预后。我国慢性乙型肝炎患者主要是B基因型和C基因型,rtA181T/V变异在这两种不同基因型间是否存在选择,不同基因型的rtA181T/V变异表现是否一致?因此,有待对上述诸多问题进行详尽的分析,为临床抗病毒治疗提供理论基础。第一章乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异的临床特征分析目的：探讨rtA181变异和临床抗病毒用药的关系,变异后患者临床特征的变化,rtA181变异的模式,与我国B、C基因型的关系,以及A181位点不同变异之间的差异。方法：1、筛选经核苷(酸)类似物治疗产生rtA181变异的慢性乙型性肝炎患者,纳入研究的85例患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》诊断。对所有患者抗病毒治疗期间的相关临床资料进行回顾,并对发生耐药时的患者肝功能、表面抗原、e抗原、HBV DNA等指标进行检测,通过PCR产物测序结果确定基因型。2、所有数据均使用SPSS13.0统计软件进行分析。患者资料中计数资料构成比采用R×C表的χ2检验,定量资料采用用独立样本t检验。以P值小于0.05时有统计学差异。结果：1、RT区A181位点变异的主要模式有8种：A181T、A181V、A181T+N236T、 A181V+N236T、A181T+A181V、A181T+M204I/V±L180M±V173L、 A181V+M204I/V±L180M±V173L、A181T+N236T+M204I等。84例(98.82%)患者接受过阿德福韦治疗。rtA181TAV变异在阿德福韦治疗组中有9例,而在拉米夫定换用阿德福韦治疗组中有33例,其分布存在统计学显著差异(P=0.046)；rtA181T/V+rtN236T变异模式在两组中分别为16例和11例,两者比较亦存在显著差异(P<0.001)；而rtA181T/V+rtM204I/V变异在两不同治疗组中分布同样存在差异(P=0.016)。2、与抗病毒治疗前相比,尽管发生rtA181耐药变异,患者临床相关指标仍可能有所改善。反映肝功能的ALT由抗病毒治疗前的175±130U/L下降至82-49U/L(P<0.001)；反映病毒复制状态的HBV DNA由5.97±1.26log10copies/mL下降至4.10±1.18log10copies/mL (P<0.001);病毒的表面抗原(HBsAg)由3.66±0.36log10COI下降到3.50±0.45log10COI (P=0.013)。但是患者HBeAg状态在治疗前后变化不大(P=0.973)。3、85患者中,13例(15.7%)为B基因型,72例(84.3%)为C基因型,未见其他基因型。B基因型患者中rtA181T变异4例,rtA181V变异9例；C基因型中rtA181T变异40例,rtA181V变异30例,rtA181T+rtA181V变异2例。不同变异在基因型分组中统计学无差异(P>0.05)。4、按照B、C基因型分组,两组患者在抗病毒治疗前临床资料相近,未见统计学差异(P>0.05)。在出现耐药时的相关临床特征(ALT、HBsAg、HBV DNA、 HBeAg等)亦没有表现出明显统计学差异(P>0.05)。5、按照rtA181T和rtA181V不同变异分组,患者在抗病毒治疗前的一般资料、生化指标、病毒水平、表面抗原水平、e抗原状态等方面比较无差异(P>0.05),但在出现变异耐药时,rtA181T突变组的HBsAg水平较rtA181V组低(3.40±0.351gCOI vs.3.62±0.541g COI, P=0.030)。与抗病毒前相比,rtA181T变异患者出现耐药时的生化、病毒指标明显下降(P<0.05)；而rtA181V变异患者耐药时病毒量和转氨酶明显改善(P<0.001),但HBsAg水平似乎变化不明显(P=0.315)。结论：1、rtA181变异主要和阿德福韦用药有关。rtA181T/V变异在拉米夫定换用(或加用)阿德福韦的治疗患者中多见；而A181T/V+N236T变异多出现在单用阿德福韦治疗的患者中。2、rtA181T/V变异后病情可能不出现大的反弹。3、B、C基因型对rtA181变异无明显影响。不同变异模式在B、C基因型中的分布无差异；不同基因型患者变异后的临床指标也相近。4、rtA181T变异和rtA181V变异患者在抗病毒治疗前的临床资料统计无差异。但在发生变异时,rtA181T变异组的HBsAg水平较rtA181V组的低。第二章乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异的病毒学特点分析目的：探讨HBV rtA181变异病毒的准种特点,以及不同变异中前C区G1896A及BCP区A1762T/G1764A变异的情况。方法：1、选部分标本对HBV逆转录酶区进行扩增,纯化回收后插入pMD18T载体,转化DH5α大肠杆菌。对每个样本挑选18个以上的克隆进行测序,经Vector NTI软件进行组装拼接,并用Chromatogram软件比对测序峰图,MEGA4、 BioEdit软件比对序列,分析病毒准种特点。2、对所有标本PCR扩增C基因区nt1623～nt2076,产物直接测序后分析BCP、pC变异与rtA181变异的关系。3、前C区和基本核心启动子变异分析采用计数资料的χ2检验。P值小于0.05时有统计学差异,所有统计学分析使用SPSS13.0软件进行。结果：1、检测到位于同一病毒株上的rtA181相关耐药组合有：A181T+M204V、 A181T+N236T、A181V+N236T,A181T+V173L、L180M+181V和A181T+N236T+M250L,尚未发现L180M+181T组合耐药变异株。2、rtA181T变异株在其病毒准种中所占比例为14.3%～95.2%;rtA181V变异株在病毒准种的比例为60.0%-100.0%。全部为rtA181V变异病毒准群的基因组距离和熵值相对较低。克隆分析还发现PCR直接测序不能检测到的rtA181D和rtA181L变异。3、C基因核心启动子A1762T和G1764A双突变在rtA181T变异组的比例明显较rtA181V变异组高(P=0.009),而前C区G1896A位点突变在rtA181变异组合CHB对照组间并没有表现出显著差异(P=0.144)。结论：1、鉴定出多种同一病毒株上的rtA181T/V伴随的组合耐药变异形式。2、rtA181T变异病毒准种中常混有野生型病毒株。rtA181变异除了常见的rtA181T和rtA181V变异外,还可有rtA181D和rtA181L等变异。3、BCP突变在rtA181T变异组中出现比例高于rtA181V变异组,高于慢乙肝对照组。第三章不同基因型1.24拷贝乙型肝炎病毒rtA181T/V突变株的构建目的：为进一步比较rtA181变异在不同基因型之间的生物学特点,构建rtA181T和rtA181V突变质粒,为下一步体外实验提供必要的条件。方法：1、利用Mizokami教授惠赠的Ae-JPN、Ba-JPN58、C-JPNAT、D-US68四株1.24拷贝HBV不同基因型的重组质粒为模板,设计错配碱基引物,通过重叠延伸PCR的方法,获得人工定点突变RT区相应片段,利用XbalⅠ和SphⅠ两个单酶切位点,与野生病毒株相应序列置换,获得不同基因型rtA181T突变和rtA181V突变病毒株。2、采用引物M13F和M13R对构建突变质粒进行PCR扩增鉴定；利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,以及EcoRⅠ单酶切对重组质粒进行酶切鉴定,初步鉴定重组突变质粒。对各基因型分别取3株rt181T突变株和rt181V突变株克隆,对插入片段DNA进行测序,确认突变质粒的正确构建。结果：构建不同基因型的rtA181T突变和rtA181V突变的pUC-HBV1.24质粒,经PCR扩增、酶切和核苷酸序列测定结果均与预期相符；pUC-HBV1.24-181T质粒的FLLA基序氨基酸突变为FLLT,而pUC-HBV1.24-181V质粒的相应氨基酸突变为FLLV,并且与野生型质粒相比,未引入其他突变位点。结论：经体外突变重组,成功构建了不同基因型rtA181T/V突变的1.24拷贝的HBV全基因突变株。第四章不同基因型乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异株体外特性研究目的：比较A、B、C、D四种基因型的rtA181T和rtA181V耐药变异病毒在体外细胞学水平上的生物学特性,为临床抗病毒及挽救治疗提供理论依据。方法：1、利用OMEGA公司的Endo-Free中量质粒抽提试剂盒提取Ae-JPN、 Ba-JPN58、C-JPNAT、D-US68四种野生型和rtA181T/V突变病毒质粒,以及pSEAP质粒。2、HepG2细胞复苏培养后,按1.5×106细胞/每孔接种至6孔细胞培养皿中,待细胞融合度80～85%时,利用X-tremeGENE HP DNA转染试剂按1：3的比例,分别将pUC-HBV1.24-181T或pUC-HBV1.24-181V质粒(5ug)和pSEAP报告基因质粒(0.1ug)共转染,并设置空转对照。转染48～72小时后收集细胞上清进行HBsAg和HBV DNA的检测。2、模拟宿主体内混合病毒株状态,将不同基因型的rtA181T突变质粒与其野生型质粒分别按0：1、1：0、1：1、1：9四种不同比例混合(转染质粒总量为5ug),与0.1ug pSEAP质粒共转染HepG2细胞。转染48～72小时后测定细胞上清中HBsAg和HBV DNA水平。4、利用SEAP试剂盒检测细胞上清中分泌性碱性磷酸酶(SEAP)的表达,以此平衡各组转染效率,并以各基因型的野生型质粒为对照换算相关结果。5、同一基因型之间统计采用独立样本t检验。若方差不齐,采用Satterthwaite近似t检验。不同基因型之间统计采用单向方差分析(One-Way ANOVA)。HBV DNA在进行统计前先进行对数转换。结果：1、rtA181T突变后明显影响HBsAg的分泌,细胞培养上清中的HBsAg几乎检测不出,只有各野生型0.33%～2.22%；而rtA181V突变后影响相对较小,HBsAg水平能维持在野生型的80%以上。各基因型中rtA181T突变和rtA181V突变之间HBsAg比较均存在显著差异(P<0.001)。2、rtA181T突变明显影响HBV颗粒的合成,大部分细胞上清中检测不到HBV颗粒,即使检测到也是较低,在102拷贝/mL水平。各基因型的rtA181T突变和rtA181V突变之间病毒颗粒的分泌均存在明显差异。3、不同基因型rtA181T突变质粒的HBsAg水平比较无统计学差异(F=1.563,P=0.272)；而不同基因型rtA181V突变质粒的HBsAg水平存在差异(F=6.261, P=0.017), A, D基因型的HBsAg水平比B基因型的水平高。4、rtA181V突变质粒的HBV DNA水平在不同基因型间存在差异(F=25.630,P<0.01),具体表现为B、C基因型的DNA水平较A和D基因型的低。5、rtA181T突变株与野生型质粒共转染后,HbsAg表达缺陷能够得到部分纠正。当野生型质粒比例占10%时,细胞培养上清液中能检测到少量HBsAg;当野生型质粒比例提高到50%左右,HBsAg水平能恢复高到50%左右。组间进行比较发现：在野生质粒50%的情况下,不同基因型的HBsAg水平存在差异(F=4.799,P=0.034)。A基因型的相对活性较高、而D基因型的活性相对较低。在野生质粒10%和0的情况下,不同基因型之间HBsAg水平无明显差异(P>0.05)。6、rtA181T突变株和野生株共转染后,细胞上清中的HBV DNA表达情况也和HBsAg近似。随着野生型质粒浓度的提高,病毒表达情况也逐渐提高,野生型质粒50%的时候,HBV DNA水平已达到40%以上。但在不同比例的混合质粒中,不同基因型之间比较均没有统计学差异(P>0.05)。结论：1、不同基因型的：rtA181T突变对病毒表面抗原释放、病毒颗粒合成都有较大的影响,但在各基因型之间比较没有明显差异。rtA181V突变对病毒的生物学特征影响较小,但在不同基因型之间存在差异。2、各基因型的野生株均能够挽救rtA181T突变株的生物学缺陷,不同基因型的挽救效果略有差别。