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前言造血干细胞移植（HSCT）是一种治疗血液恶性疾病、骨髓造血功能障碍以及多种难治性贫血的有效方法。尽管随着科学技术的不断进步，初治各种恶性血液病缓解率已得到很大提高，但长期生存仍不尽人意。因此，提高造血干细胞移植的质量是需要我们长期关注的。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）联合造血干细胞移植可以促进造血的重建，但造血干细胞归巢率低、增殖能力有限是移植中的主要问题之一，而MSCs作为骨髓造血的支持细胞，通过分泌各种基质细胞衍生因子、细胞因子、粘附分子促使HSCs归巢定植到骨髓，其中基质细胞衍生因子SDF-1及其受体CXCR4在促进HSCs归巢、增殖；促进骨髓造血的恢复方面有重要意义。HOXB4在造血干细胞中高表达，在调节HSCs自我更新与分化间的平衡发挥着重要的作用。HOXB4基因的表达能够有效地增强HSCs的自我更新效应，因此我们构建SDF-1、HOXB4和SDF-1/HOXB4融合基因3个腺病毒表达载体，在293A细胞中进行的包装和病毒滴度测定，并转染体外培养的MSCs细胞，检测3个外源基因在MSCs的表达，制备滋养层和CD34+细胞共培养，探讨其对CD34+细胞体外扩增及干性维持的影响。研究方法1.全基因合成SDF1/HOXB4基因序列，以构建的含有正确序列的序列为模板，经PCR扩增、电泳回收目的片段、酶切、质粒连接、重组、质粒筛选、测序鉴定后，构建序列正确的表达SDF-1、HOXB4和SDF-1/HOXB4基因的3种腺病毒载体。2.3种腺病毒载体转染至293A细胞，进行病毒包装、反复冻融、多次扩增获得病毒原液，采用免疫法DAB显色进行腺病毒滴度的检测。3.采用密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞，用CD90-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、CD34-PE抗体标记MSCs细胞，进行流式检测其表面标记的表达。将3个腺病毒转染至体外培养的MSCs，分别为SDF-1组、HOXB4组和S-H组，转染空腺病毒载体的为阴性对照，共分为4组，观察荧光的表达，并在转录水平及蛋白水平分别检测MSCs细胞中3个外源基因表达。4.利用密度梯度离心法和磁珠分选法分选人脐血CD34+细胞，并进行流式和甲基纤维素集落培养检测，4组转染后的MSCs经过60Coγ射线照射（30Gy）制备滋养层，然后和CD34+细胞体外共培养7d，计数扩增细胞数目并流式检测其CD34表达。研究结果1、测序表明3种腺病毒载体构建成功，在293A细胞中成功包装并获取病毒，Ad-SDF1-IRES2-EGFP病毒的滴度为：1.05×1011ifu/mL，Ad-HOXB4-IRES2-EGFP病毒的滴度为：1.2×1011ifu/mL，AD-SDF-1-（GlySer）3-HOXB4-IRES-EGFP病毒的滴度为：1×1011ifu/mL。2、成功培养了人骨髓间充质干细胞（MSCs）。对MSCs的表型进行流式细胞术分析，结果显示CD90表达率91.0%，CD34表达率0.992%，CD45表达率0.599%，CD44表达率97.5%，符合MSC的表型特点。3、3个腺病毒在MSCs成功表达，RT-PCR和Western blot检测出3个基因在MSCs细胞中的表达实验组明显高于对照组，4、成功分选出脐血CD34+干细胞，进行流式细胞术检测，细胞纯度由分选前得2.87%上升至分选后的99.2%。分选后的CD34+细胞利用甲基纤维素培养基培养14d后CFU-E、CFU-M、CFU-G和CFU-GEMM陆续出现，提示分选后CD34+细胞干性和分化能力都满足实验要求。5、MSCs滋养层和CD34+细胞共培养7d后,扩增细胞数目SDF-1组（9.52±2.24）、S-H组（8.11±2.34）显著高于对照组（4.85±2.53）（P＜0.05），HOXB4组（5.74±2.43）和对照组相比无差异（P>0.05）。3种实验组之间相比，扩增细胞数目SDF-1和S-H两组、S-H和HOXB4两组相比无统计学意义（P>0.05），SDF-1和HOXB4两组间有显著差异（P<0.05）。S-H组扩增后流式检测CD34+细胞为1.85%，其比例明显高于其他几组，阴性对照组CD34+细胞的表达为0.59%、SDF-1组表达为1.20%、HOXB4组表达为1.28%。SDF1-HOXB4细胞组的荧光强度曲线的右侧线明显右移。结论3个腺病毒表达载体pAD-SDF-1-IRES-EGFP、pAD-HOXB4-IRES-EGFP、pAD-SDF-1-（GlySer）3-HOXB4-IRES-EGFP构建成功，转染MSC后能够在细胞中表达目的蛋白，其中融合基因S-H组对CD34+细胞体外扩增及干性维持作用更好。