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第一部分半胱氨酸残基氧化-还原修饰对海马CA1区突触可塑性的调节作用及机制目的:半胱氨酸残基的氧化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰。蛋白质半胱氨酸残基通过不同程度的氧化形成多种修饰形式,如-S-S-;-S-OH;-SO3;-SSG等,这种修饰与蛋白质磷酸化修饰一样,是两种进化上高度保守的蛋白翻译后修饰之一,改变蛋白质的结构及活性。目前,国内外关于半胱氨酸残基的氧化修饰在突触生物学中的作用研究较少,很多问题尚未阐明。本课题通过药理学方法选择性的还原蛋白质半胱氨酸残基的氧化状态,研究其对衰老状态下海马CA1区突触传递长时程增强(LTP)损伤的调节作用,并重点探讨其对LTP的两个关键因素:NMDA受体激活和AMPA受体上膜的影响。方法:急性分离大鼠海马脑片,电生理记录,Western blotting技术,BS3交联法分析膜蛋白,膜蛋白提取。结果:选择性巯基氧化剂DTNB抑制青年大鼠海马CA1区NMDA受体功能及NMDA受体介导的LTP;反之巯基还原剂DTT则可增强青年大鼠海马CA1区NMDA受体功能及其介导的LTP。巯基还原剂DTT、β-ME、还原型谷胱甘肽恢复衰老大鼠海马CA1区NMDA受体功能及NMDA受体介导的LTP;但强抗氧化剂维生素C和维生素E无此作用。巯基还原剂DTT能逆转过氧化氢引起的LTP损伤,而抗氧化剂只能预防过氧化氢引起的LTP损伤。巯基还原剂DTT、p-ME增强海马CA1区神经元的(?)UMPA受体上膜并增加AMPA受体电流,该作用与其减少PICK1介导的AMPA受体内吞有关。巯基还原剂DTT、p-ME能抑制低频刺激诱发的海马CA1区突触传递长时程抑制(LTD)。氧化应激病理条件下,会改变巯基还原状态,从而引起海马CA1区AMPA受体下膜。结论:半胱氨酸残基的氧化修饰影响海马CA1区NMDA受体功能和AMPA受体膜转运,从而损伤青年和老年鼠的海马突触可塑性。巯基还原剂则可增加NMDA受体功能和AMPA受体膜转运,部分恢复衰老引起的可塑性损伤。第二部分半胱氨酸残基硫巯基化修饰对海马CA1区突触可塑性的调节作用及机制目的:研究发现,半胱氨酸残基不仅可发生形式多样的氧化修饰,还能发生一种可增强其还原状态的翻译后修饰——硫巯基化修饰(S-sulfhydration,-SSH)。这种修饰主要由硫化氢气体信号分子介导产生。近年来发现硫化氢和神经退行性疾病密切相关。最新研究表明,硫化氢通过硫巯基化修饰蛋白质半胱氨酸残基,调节靶蛋白的结构和活性。目前,关于这种硫巯基化修饰在突触可塑性中的作用鲜有报道。这种硫巯基化修饰可被预先给予DTT所阻断。本课题通过药理学方法,研究半胱氨酸残基硫巯基化对突触可塑性中两个关键因素:NMDA受体激活和AMPA受体上膜的调控作用,以及其对衰老状态下海马CA1区LTP损伤的调节作用,并初步探讨其分子机制。方法:急性分离大鼠海马脑片、电生理记录、Western blotting技术、BS3交联法分析膜蛋白和硫巯基化蛋白分析。结果:硫化氢介导的半胱氨酸残基硫巯基化介导了其对海马CA1区NMDA受体功能和AMPA受体上膜过程的增强作用。这种增强作用可能来自于硫化氢引起的突触后LTP相关多条信号通路的激活。进一步研究发现,内源性硫化氢信号对高频刺激诱发LTP是一种必不可少的信号分子。使用硫氢化钠孵育脑片,补充减少的硫化氢信号,可以增加衰老鼠海马CA1区硫巯基化蛋白数目,部分恢复衰老鼠CA1区神经元的NMDA受体功能,并引起LTP相关多条信号通路的激活,从而恢复衰老引起的海马CA1区LTP损伤。结论:半胱氨酸残基的硫巯基化修饰增强海马CA1区NMDA受体功能和AMPA受体膜表达,易化青年和老年鼠海马CA1区的突触可塑性,并部分恢复衰老引起的LTP损伤。第三部分蛋氨酸残基氧化还原修饰对神经细胞氧化应激损伤的保护作用及机制目的:蛋白质蛋氨酸残基的硫甲基结构在一定条件下和活性氧结合形成亚砜,随后在内源性蛋氨酸亚砜还原酶A (MsrA)的作用下还原成蛋氨酸,这一蛋氨酸氧化-还原循环在体内氧自由基清除、蛋白质功能维持等过程中发挥重要作用。虽然现有的研究结果认为,这一过程主要依赖于硫甲基的抗氧化特性,MsrA只起到维持还原态蛋氨酸浓度的作用。但该理论不能解释很多实验现象,如:体外发生蛋氨酸氧化需要很高的氧化剂浓度;衰老过程中各种组织氧化应激损伤加重,MsrA表达明显下降,但总的氧化型蛋氨酸比例却未出现相应升高等。我们推测:体内蛋氨酸和活性氧的反应需要MsrA催化,是一种酶促的活性氧清除反应。因此本研究进一步探讨MsrA参与蛋氨酸氧化-还原循环,发挥抗氧化应激损伤的作用机制,并初步研究两种新发现的MsrA调节剂的神经细胞保护作用。方法:细胞培养,MTT染色,台盼蓝染色,PI染色,LC-MS, Western blotting,生化检测,基因重组蛋白表达等。结果:体外鲁米诺反应发现,加入有活性的MsrA会明显易化L型蛋氨酸(L-Met)和体外活性氧的反应,并加速DTT和过氧化氢的体外反应。细胞实验发现,较低浓度下的L-Met (1-5mM)介导的抗氧化应激作用可以被MsrA的功能性抑制剂DMSO所取消。进一步发现,低浓度的白藜芦醇(RSV)可诱导SH-SY5Y细胞中MsrA的表达和功能增加,从而增加SH-SY5Y细胞对抗氧化应激和神经毒素的能力。小分子二甲基硫醚(DMS)可增强MsrA催化的氧化-还原循环,具有显著的神经细胞保护活性。结论:调节MsrA的表达或功能可产生显著的神经细胞保护作用,其机制可能和MsrA催化的硫甲基氧化-还原作用密切相关。