河蚬(Corbicula fluminea)活性糖蛋白和多糖的分离纯化及其抗病特性

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河蚬(Corbicula fluminea)是一种双壳类软体动物,在传统中医药中具有治疗肝病、麻疹和退热等功效,其资源丰富,具有一定的开发利用潜在价值。 本文以体外抑制肝癌细胞为筛选模型,从河蚬中分离纯化到一种糖蛋白,从细胞凋亡角度探讨其抑制肝癌细胞的作用机制;研究了河蚬多糖的提取工艺,探讨河蚬多糖抑制烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)侵染的作用和其体外抗氧化活性。其主要研究结果如下: 采用硫酸铵分级沉淀,Blue Sepharose 6 Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow和HPLC柱层析,从河蚬中分离纯化一种碱性糖蛋白,定名为CFp-a。采用HPLC对该组分进行纯度鉴定,证明CFp-a已得到纯化。经SDS-PAGE测定,其相对分子量为24.0 kDa。经苯酚硫酸法测定,其含糖量为2.3%。在其氨基酸组成中苯丙氨酸(Phe)含量最高,半胱氨酸(Cys)和酪氨酸(Tyr)次之,不含脯氨酸(Pro)。 利用四氮唑还原法(MTT)、透射电镜和流式细胞仪(FCM)检测CFp-a对体外人肝癌细胞BEL7404的作用。结果表明,CFp-a对肝癌细胞BEL7404具有抑制增殖作用,处理72h后,IC50为46ug·mL-1。利用透射电镜观察经CFp-a处理的癌细胞,发现它们具有细胞凋亡的形态学特征,如细胞膜表面微绒毛部分脱落,细胞质中有大量空泡,细胞核浓缩,核染色质凝集成块并向周边集结,胞浆内可见自噬体形成。不同浓度的CFp-a作用于BEL7404细胞后,FCM结果显示在DNA直方图上出现明显的亚“G1”凋亡峰,细胞凋亡率呈一定的量效关系和时效关系。从细胞周期的角度分析,CFp-a对细胞周期中的G1-S和G2-M期检查点均有影响。以上结果表明,CFp-a具有明显抑制BEL7404细胞生长和诱导肝癌细胞凋亡的作用。 分别采用两种方法从河蚬中提取多糖。通过单因素试验确定提取多糖COGⅠ的最佳提取方案:0.1moL·L-1 NaOH,浸提时间为8h。通过正交试验确定提取COGⅡ的最佳提取条件:等体积的水,100℃,浸提0.5h。方法一的多福建农林大学博士学位论文糖组分为COGI,方法二的提取物的组分为COL,其多糖组分为COGn。两种多糖冻干品都呈纯白色絮状,易溶于水,不溶于有机溶剂。硫酸根离子定性检测,coGI和coGll均含有s时一。红外光谱分析初步确定coGI和c0Gll为毗喃型糖。 采用半叶法检测河规多糖对烟草花叶病毒(Tabmosaicvir。,TMv)的抑制作用,研究表明河蛆多糖COGI对们MV没有明显抑制作用。而河蚁多糖COGll对TMV具有明显的抑制作用。提纯的TMV与河蚁多糖COGn混合后,在透射电镜下观察到部分TMV的粒体形态没有变化,但多糖吸附在病毒表面,部分TMV粒体发生崩解。通过系统侵染试验,利用EUSA方法检测病毒含量,结果表明提前24h施用河规多糖的处理效果好于提前3h喷施的效果。 采用分光光度法检测河规多糖COGI和COGn体外抗氧化的作用,结果表明COGI和COGll具有体外直接清除轻基的作用,COGn清除轻基的活性高于COGI,且河规多糖对轻基的清除作用呈剂量依赖性。
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