近年来,由于环境变化、自然灾害、物种多样性、抗生素大规模使用等因素,导致各类病原体引起的传染性疾病不断爆发,如非洲猪瘟病毒、埃博拉病毒、禽流感病毒等。在临床医学方面,病原体感染是引发肝炎、结核、肿瘤等多种疾病的重要诱因。传统的病原体检测方法具有检测目标单一、实验操作复杂、对环境及人员要求高等不足,难以满足病原体快速检测的需求。本论文针对多种病原体一体化快速并行检测难题,提出并建立了一种多重巢式固相PCR扩增新方法,通过构建固相PCR-Array芯片和引入巢式PCR扩增方法,提高了检测通量和多重检测的特异性、灵敏度;结合微流控芯片技术,根据检测对象不同,研究芯片上病原体核酸快速富集与纯化方法,在一块芯片上完成细菌和病毒核酸提取,多重巢式固相PCR扩增和产物检测等过程,实现了多种病原体一体化、快速、并行检测。具体研究内容包括:(1)微流控固相PCR芯片研究及反应体系建立将微流控芯片与固相PCR技术相结合,通过探究不同固相引物浓度和紫外交联时间对固相PCR扩增效率的影响,制备了固相PCR-Array芯片,提高了检测通量。引入巢式PCR扩增方法,提出并建立了微流控芯片上多重巢式固相PCR扩增新方法,研究了不同游离上下游引物比值对巢式固相PCR扩增效率的影响。以4种病原体的质粒为测试样品,对多重巢式固相PCR-Array芯片同时检测多种病原体基因的特异性和灵敏度进行测试,结果表明,在优化的实验条件下,多重巢式固相PCR-Array芯片最低检测限达10 copies/μL量级。该方法的建立为多种病原体快速并行检测难题提供了解决方案。(2)一体化微流控核酸分析芯片设计及实验研究本部分在已建立的多重巢式固相PCR-Array芯片检测新方法基础之上,利用微流控芯片易于集成的优势,提出并设计了基于磁珠法核酸提取原理的微流控核酸分析芯片,该芯片将细菌和病毒核酸提取、多重巢式固相PCR扩增及产物检测集成到一张芯片上。为实现检测过程的自动化,芯片内部采用U型管结构设计,使得腔体自然隔离,有利于试剂的时序性驱动。选择埃博拉病毒、新疆出血热病毒、炭疽杆菌、布鲁氏菌四种具有代表性的烈性病原体为研究对象,分别构建了4种病原体的阳性质控品,并对其进行了精确定量,为一体化微流控芯片上烈性病原体检测实验开展提供了样品来源。以此为实验样品,对一体化微流控核酸分析芯片提取细菌和病毒核酸的质量、灵敏度和重复性等指标进行评价,结果表明,一体化微流控核酸分析芯片提取细菌DNA的灵敏度为102 CFU/mL,提取病毒RNA的灵敏度为104copies/mL,重复实验的相对标准偏差(RSD)小于2%,结果表明,一体化微流控核酸分析芯片可实现4种烈性病原体的快速并行检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优势。(3)集成化微流控HPV基因分型芯片设计及实验研究设计了基于热裂解法核酸提取原理的集成化微流控芯片,将HPV病毒DNA快速提取、巢式固相PCR扩增及产物检测集成到一张芯片上。改进芯片上气动微阀设计,使其兼具试剂混合和存储功能,大大降低了芯片的复杂程度,缩小了芯片体积。以HPV16/HPV18/HPV31/HPV33/HPV58 5种高危型HPV基因分型阳性质控品为实验样品,对集成化芯片提取HPV DNA的性能以及检测各基因分型的特异性、灵敏度和准确性进行评价,实验结果表明,该芯片最低可提取约为103 copies/mL HPV病毒;提取DNA浓度与初始HPV 阳性质控品浓度呈良好的线性关系,R2值为0.983,表明该芯片提取HPV病毒DNA重复性较好。开展了 20例临床女性宫颈拭子样品中HPV基因分型鉴定实验,同期采用传统检测方法在国际先进仪器设备上进行了对比实验,结果表明,集成化微流控HPV基因分型芯片检测结果与传统方法检测结果一致,准确性达100%,可在1h内可完成5种基因分型的鉴定两者相比较而言,大大降低了试剂成本和检测时间。综上所述,本文针对不同病原体检测需求,设计了不同类型的一体化微流控核酸分析芯片,芯片集成了核酸提取、扩增与检测等实验环节,可实现多种病原体的高灵敏、高特异、快速和并行检测,为病原体感染性疾病传播、诊断和控制提供了一种通量高、功能集成、成本低廉和操作简便的核酸分析平台。