研究背景和目的硅橡胶(Silicone Rubber,SR)由于具备在体内不变性、不降解等稳定的理化特性,成为目前整形外科最常用的植入假体材料,如硅胶鼻假体、硅胶乳房假体、扩张器等。但受限于硅橡胶假体表面与人体组织的低相容性,最终会形成由大量胶原蛋白和少量成纤维细胞组成的纤维包膜将假体包裹其中。随时间进展,包膜可逐渐增厚,在一定诱因下还可发生挛缩,最终导致假体变形移位,引起局部发硬、疼痛、畸形等,严重影响手术预后及患者生活质量。包膜的形成和挛缩是在异物存在情况下植入创面愈合的结局,这一过程与成纤维细胞的生物行为密切相关。研究表明生物材料表面的物化性能如表面硬度、形貌、亲疏水性、电荷、化学基团等对细胞的粘附、増殖及分化等生物行为产生影响。探明硅胶橡假体表面物化性能与成纤维细胞生物行为之间的关系,对明确硅橡胶假体相关并发症的病因,寻求构造性能更优的硅橡胶材料,提高临床治疗效果具有重要价值。本课题旨在通过探讨硅橡胶硬度对人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblasts,HDFs)增殖以及胶原合成的影响,为开发更优硅橡胶材料提供思路。研究方法一、不同硬度SR的制备及表面性能检测1、室温下将液态A、B型硅胶按1:9,2:8,…,9:1的比例充分混合,采用特制模具制备100 mm×100 mm×1 mm规格的硅橡胶膜,静置固化后选取表面光整、无气泡的硅橡胶膜备用。2、表面硬度检测:采用邵氏A型硬度计对各个硅橡胶样本的表面硬度进行测量(注:A:B=1:9组在室温条件下未达到完全固化,弃用)。3、拉伸强度和断裂伸长率检测:应用微机万能材料试验机进行拉伸试验,检测各组SR的抗拉伸强度和断裂时的伸长率。4、表面形貌对比:应用原子力显微镜(AFM)检测对比硬度最高和最低的两组硅橡胶样本的表面微形貌。5、表面化学基团及元素组成对比:应用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)及X-射线电子能谱仪(XPS)检测对比硬度最高和最低的两组硅橡胶样本表面的化学官能团和组成元素。6、表面亲疏水性对比:应用水接触角测定仪测定上述两组硅橡胶样本的表面水接触角。二、不同硬度SR对成纤维细胞增殖及胶原合成的影响1、成纤维细胞的获取:从健康男童包皮(取得患者知情同意并通过伦理学审查)提取原代真皮成纤维细胞,传代后取第4代以后细胞进行后续实验。2、观察细胞在硅橡胶材料表面的粘附情况:将HDFs接种在不同硬度硅橡胶表面,分别在24 h、48 h、72 h在倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况及细胞形态。3、细胞增殖实验:应用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测HDFs在不同硬度硅橡胶材料上的细胞增殖情况并进行对比评价。4、对HDFs合成胶原的检测:选取所有SR样本中硬度最高(Stiff组,A:B=9:1)、硬度最低(Soft组,A:B=2;8)(同时也是成纤维细胞增殖差异最大的两组)的硅橡胶样本进行实验。分别采用α-SMA ELISA试剂盒、CollagenⅠELISA试剂盒检测两组硅橡胶上HDFs表达α-SMA及CollagenⅠ的情况,并进行评价对比。三、SR硬度影响成纤维细胞增殖及胶原合成的初步机制探索1、实验分组:正常组:Soft+PBS,Stiff+PBS;3-MA 组:Soft+3-MA(5 mM),Stiff+3-MA(5 mM);雷帕霉素组:Soft+雷帕霉素(100 nM),Stiff+雷帕霉素(100 nM)。2、自噬标志蛋白的检测:将HDFs接种到硅橡胶材料上,预培养24 h后,加入上述自噬抑制剂及诱导剂,处理后4 h,运用Western Blot法分别检测各组硅橡胶上HDFs表达自噬标志蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ、p62的情况,并进行对比评价。3、自噬对HDFs增殖的影响:应用CCK-8试剂盒检测上述各组处理后细胞增殖情况,并通过激光共聚焦显微镜观察各组硅橡胶材料上HDFs表达细胞骨架蛋白(F-actin)的情况。4、自噬对HDFs胶原合成的影响:采用α-SMA ELISA试剂盒、CollagenⅠELISA试剂盒检测3-MA组、雷帕霉素组硅橡胶上HDFs表达α-SMA及CollagenⅠ的情况,并进行评价对比。研究结果1、采用简易法制备了8组不同硬度的硅橡胶薄膜材料,并对各组的邵氏硬度进行了定量测定,发现随着B型液态硅胶占比增加,硅橡胶的硬度逐渐下降,所有材料的邵氏硬度介于3.0~13.0 HA之间。2、拉伸试验结果显示随着SR硬度增加,材料的断裂伸长率相应增加,但硬度过高和过低时,SR的拉伸强度均较低。3、用AFM观察了Stiff组、Soft组硅橡胶的表面形貌,结果证实两组无显著差异,表面形貌在该实验中不是导致细胞生物行为差异的因素。4、FTIR及XPS检测结果均无显著差别,说明两组SR的表面化学官能团不存在明显差异,表面化学性能不是造成细胞生物行为差异的因素。5、两组SR表面水接触角结果无显著差别,说明硬度改变并未造成SR表面的亲疏水性改变。6、通过观察HDFs在各组不同硬度SR表面的粘附情况,细胞均可良好地贴壁生长,细胞形态呈正常成纤维细胞形态,铺展充分,说明A、B型硅胶的不同比例组合并无明显的细胞毒性。7、增殖实验结果显示HDFs的增殖能力随着硬度的增加而增加,在Stiff组上明显优于Soft组。表明SR的硬度对HDFs的增殖有显著影响——高硬度SR促进HDFs增殖。8、ELISA检测HDFs表达α-SMA及CollagenⅠ的结果显示,Soft组上细胞表达达α-SMA及CollagenⅠ均显著高于Stiff组,表明SR硬度可显著影响HDFs的胶原合成以及影响成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。9、自噬相关标志蛋白检测及干预细胞自噬后的相关实验结果显示,抑制自噬可以一定程度抑制HDFs增殖并增强α-SMA和CollagenⅠ的表达量,促进自噬可一定程度促进HDFs增殖并降低α-SMA和CollagenⅠ的表达量。研究结论1、经A、B型硅胶通过物理混合制备的不同硬度硅橡胶材料,除硬度不同外,其余表面物化性能无显著差异,可以基本确定硅橡胶硬度是影响该研究结论的主要因素。2、硅橡胶硬度是影响HDFs增殖及其向肌成纤维细胞转化、胶原合成的一个重要因素。3、细胞自噬可能是硅橡胶硬度影响HDFs增殖及其向肌成纤维细胞转化、胶原合成的途径之一,但SR硬度具体如何介导细胞自噬还待进一步深入研究。