论文部分内容阅读
β-1,3-葡聚糖广泛存在于自然界,是由葡萄糖以β-1,3-糖苷键连接而成的高分子多聚物。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的主要组成成分,对真菌的生长具有重要作用。β-1,3-葡聚糖酶能够水解β-1,3-葡聚糖成为葡萄糖和小分子寡糖,广泛存在于植物、微生物中。由于β-1,3-葡聚糖酶在植物病原真菌的生物防治方面具有重要的应用价值,受到了人们的关注。 本研究课题根据 GenBank中的基因信息,通过 PCR方法,从盾壳霉中扩增出2300 bp的β-1,3-葡聚糖酶cmg1,该基因属于第55家族糖苷水解酶,通过序列分析, AT含量为41.19%,编码792个氨基酸,其中N端24个氨基酸残基为信号肽,去掉信号肽的cmg1基因,编码768个氨基酸,分子量为84.4 kDa。 将cmg1克隆到真核表达载体pPIC9K上,转化到大肠杆菌DH5中,然后经过BglⅡ线性化,通过电转化方法转化到毕赤酵母中,实现了cmg1在真核中的表达。 将cmg1克隆到原核表达载体pET-28a上,转化到大肠杆菌BL21中,利用IPTG诱导表达β-1,3-葡聚糖酶,结果表明在IPTG终浓度为0.2mmol/L,25℃条件下培养,该酶表达情况良好,获得与预期分子量大小相符(84.4kDa)的表达产物。采用His标签亲和纯化系统对β-1,3-葡聚糖酶进行纯化,并测定β-1,3-葡聚糖酶的酶学性质。结果表明,在pH6.0和55℃条件下β-1,3-葡聚糖酶表现出最高活性。动力学研究表明,β-1,3-葡聚糖酶在以昆布多糖为底物时, Km=9.08 mg/mL,Vmax=6.96μg/mg?min。 根据与第55家族β-1,3-葡聚糖酶的同源序列分析比较,CMG1包括一个分泌信号肽,C端结构域、N端结构域以及两个结构域之间的链接区域。通过三维建模和分子对接,选择可能与糖链结合有关的10个氨基酸进行研究。通过寡聚核苷酸介导的定点突变技术,对E669、K88、Q179、M158、Q260、S239、W282、S206、S207、S780分别进行突变,将突变载体转化到大肠杆菌中,利用与野生型菌株相同的表达条件进行诱导,对重组蛋白的酶活性进行测定,结果表明突变酶的酶活性降低。 以草莓灰霉(Botrytis cinerea)等5种植物病原真菌,用野生型β-1,3-葡聚糖酶进行抑制真菌菌丝生长的抑菌实验。结果表明,野生型β-1,3-葡聚糖酶,对不同真菌菌丝的生长具有不同的抑制作用,对草莓灰霉的抑菌效果相对较强,对花生叶霉、苹果轮纹菌、水稻纹枯病菌、核盘菌的抑制效果相对较弱。