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目的现代社会,非酒精性脂肪肝发病率持续增高,年龄范围逐渐扩大。临床发现,部分非酒精性脂肪肝患者发病与社会应激明显相关,辨证以肝郁为主,疏肝治疗效果显著。实验发现应激后HPA轴变化会导致胰岛素抵抗与脂质代谢异常。因此提出,对应激相关非酒精性脂肪肝,应重视从肝郁论治,其作用可能体现在对HPA轴、脂质代谢与转运、胰岛素抵抗与氧化应激的系统调节。本课题采用慢性束缚复合高脂饲料建立痰郁互结型非酒精性脂肪肝病证结合动物模型,应用证候评价、病理切片等评价肝郁加重非酒精性脂肪肝的病变特点,检测皮质醇水平、胰岛素抵抗指数、脂质代谢酶、肝功能等相关指标,观察HPA轴、脂质代谢与转运、胰岛素抵抗与氧化应激多层面的变化,并探讨四逆散对上述的干预作用。从而揭示肝郁加重肝脂肪变的作用和机制,阐明从"肝郁"论治脂肪肝的重要性,为临床上大量应激相关非酒精性脂肪肝患者的治疗提供参考。方法(1)健康雄性Wistar大鼠70只,体重250±10g,实验前适应性饲养1周,自由进食进水,经旷场实验筛选后随机区组分为空白组(n=8),正常条件饲养,4只/笼,不接受任何刺激;HFD组(n=8),自配高脂饲料饲养,4只/笼,不接受任何刺激;CS组(n=8),正常条件饲养,4只/笼,每日束缚6小时(7:00am-1:00pm);复合模型组(n=8),高脂饲料饲养,4只/笼,每日束缚6小时(7:00am-1:00pm);四逆散组(n=8),高脂饲料饲养,4只/笼,每日束缚6小时(7:00am-1:00pm),从实验第4周(第29天)开始至实验第8周(56天)结束,每日灌服四逆散水煎剂4.5mL/kg,生药量4.0g/(kg*d),相当于60kg成人体重的临床用药量;红曲组(n=8),高脂饲料饲养,4只/笼,每日束缚6小时(7:00am-1:00pm),从实验第4周(第29天)开始至实验第8周(56天)结束,每日灌服红曲水煎剂4.5mL/kg,生药量0.12g/(kg*d),相当于60kg成人体重的临床用药量;联合组n=8),高脂饲料饲养,4只/笼,每日束缚6小时(7:00am-1:00pm),从实验第4周(第29天)开始至实验第8周(56天)结束,每日灌服四逆散联合红曲水煎剂4.5mL/kg,生药量4.12g/(kg*d),相当于60kg成人体重的临床用药量。造模时间8周,给药4周。(2)每日观察实验动物一般情况、记录摄食量,每2周进行体重、旷场实验得分、糖水偏嗜度的检测记录。称量内脏脂肪,计算内脏肥胖指数。用以评价中医证候模型。(3)应用病理切片、紫外-乳酸脱氢酶法、紫外-苹果酸脱氢酶法检测各组大鼠ALT、AST的含量;称量肝重、脾重,计算肝指数。用以评价疾病模型。(4)应用rt-PCR、放射免疫分析法检测海马体皮质醇受体mRNA基因表达与血清ACTH、皮质醇的含量。用以评价HPA轴状态。(5)应用胆固醇氧化酶法、甘油磷酸氧化酶法、直接法、rt-PCR检测大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL、肝内HMG-CoA还原酶mRNA表达。用以评价脂质代谢与转运水平。(6)应用放射免疫分析法、葡萄糖氧化酶法、冰冻切片氧化应激超氧阴离子红色荧光测定试剂盒检测大鼠血清胰岛素、空腹血糖、肝组织ROS等,用以评价胰岛素抵抗与氧化应激水平。结果(1)比较各组大鼠体重,结果显示复合模型组较空白组体重无显著性变化(P>0.05),经四逆散治疗后无显著变化(P>0.05)。旷场实验结果显示:模型建立后复合模型组总得分较空白组显著减少(P<0.01),经四逆散治疗后增加(P<0.05)。糖水实验结果显示:复合模型组糖水偏爱百分比均值低于空白组,经四逆散治疗后均值增加。摄食量结果显示:复合模型组摄食量较空白组显著减少(P<0.01),经四逆散治疗后增加(P<0.05)。内脏肥胖指数结果显示:复合模型组内脏肥胖指数较空白组显著增加(P<0.05),经四逆散治疗后较空白组无统计学差异(P>0.05)。证候评分结果显示:复合模型组肝郁与痰湿证评分均高于空白组(P<0.01),经四逆散治疗后降低(P<0.05)(2)病理切片结果显示:复合模型组油红O染色着色面积明显多于空白组,经四逆散治疗后着色面积明显减少。血清AST结果显示:复合模型组大鼠血清AST较空白组显著升高(P<0.01),经四逆散治疗后显著降低(P<0.01)。血清ALT结果显示:复合模型组大鼠血清ALT较空白组显著升高(P<0.01),经四逆散治疗后无显著变化(P>0.05)。肝指数结果显示:复合模型组肝指数较空白组显著增加(P<0.01),经四逆散治疗后降低(P<0.05)。(3)海马体皮质醇受体mRNA相对表达量结果显示:复合模型组较空白组显著降低(P<0.01),经四逆散治疗后升高(P<0.05)。血清皮质醇结果显示:复合模型组大鼠血清皮质醇较空白组明显升高(P<0.05),经四逆散治疗后低(P<0.05)。(4)血清总胆固醇结果显示:复合模型组较空白组无显著变化(P>0.05),经四逆散治疗后血清总胆固醇显著降低(P<0.01)。血清甘油三酯结果显示:复合模型组较空白组无显著变化(P>0.05),经四逆散治疗后无显著变化(P>0.05)。血清FFA结果显示:复合模型组较空白组血清FFA显著升高(P<0.01),经四逆散治疗后降低(P<0.05)。血清HDL结果显示:复合模型组血清HDL明显降低(P<0.05),经四逆散治疗后无显著变化(P>0.05)。血清LDL结果显示:复合模型组血清LDL明显升高(P<0.05),经四逆散治疗后显著降低(P<0.01)。肝内HMG-CoA还原酶mRNA表达:复合模型组较空白组显著升高(P<0.01),经四逆散治疗后显著降低(P<0.01)。(5)氧化应激超氧阴离子红色荧光冰冻切片结果显示:复合模型组荧光强度明显强于空白组,经四逆散治疗后荧光强度明显减弱。胰岛素抵抗指数计算结果显示:复合模型组较空白组显著升高(P<0.01),经四逆散治疗后无显著变化(P>0.05)。血清TNF-a结果显示:复合模型组较空白组明显升高(P<0.05),经四逆散治疗后降低(P<0.05)。结论(1)应激因素可以直接诱导非酒精性脂肪肝的发病,导致肝脏出现实质性损伤,并且可以通过影响脂质代谢与转运、加剧胰岛素抵抗程度加重非酒精性脂肪肝。即肝气郁结是非酒精性脂肪肝发病的主要病机之一。(2)四逆散可以通过改善HPA轴状态、氧化应激状态、脂质代谢与转运状态系统调节应激相关非酒精性脂肪肝,即痰郁互结型非酒精性脂肪肝。