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目的本试验以围产期脂肪肝奶牛和体外奶牛脂肪肝细胞模型为研究对象,运用腺病毒转染技术过表达SIRT1基因,研究SIRT1对奶牛肝细胞氧化应激状态、SIRT1基因和蛋白表达水平及下游脂代谢相关蛋白和关键酶表达水平和活性及肝脂沉积的影响,明确SIRT1在奶牛脂肪肝病发生中的作用机制,为阐明奶牛脂肪肝的发病机制和寻找治疗靶点奠定理论和实验基础。方法选取12头奶牛,颈静脉采集血液分离出血清,常规方法处死后无菌采集肝脏组织样品,经检测血清和肝脏组织TG含量,筛选出6头为对照奶牛、6头为脂肪肝奶牛。采用改良胶原酶两步灌流法分离培养新生犊牛肝细胞,添加不同浓度OA溶液(0、0.25、0.5、0.75 m M)作用不同时间点确定最佳体外奶牛脂肪肝细胞模型OA添加浓度和时间。体外培养奶牛脂肪肝细胞到最佳生长状态,一部分添加NEFAs、NAC、NEFAs+NAC处理细胞肝细胞,另一部分转染适量过表达SIRT1腺病毒,于肝细胞培养结束收集细胞。采用生化分析仪检测脂代谢指标;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清和肝脏组织中氧化抗氧化指标;采用免疫荧光技术确定最佳重组腺病毒添加量;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR法)检测SIRT1基因及其下转录因子的m RNA表达水平;采用蛋白质印迹法检测肝脏组织和肝细胞中SIRT1基因及其下游转录因子的蛋白表达水平。试验结果1.与对照奶牛相比,脂肪肝奶牛血清中肝功能指标ALT、ALP极显著升高(P<0.01)(P<0.01),TP显著升高(P<0.05),GLU显著降低(P<0.05),脂代谢指标TG、TC升高但不显著(P>0.05),氧化抗氧化指标ROS浓度显著升高(P<0.05)、CAT、Cu Zn-SOD浓度极显著降低(P<0.01);肝脏组织中脂代谢指标TG、LDLC浓度极显著升高(P<0.01),TC浓度变化不显著,氧化抗氧化指标ROS浓度显著升高(P<0.05)、LPO的浓度极显著降低(P<0.01)、Mn-SOD、GSH、GSH-Px在血清以及肝脏组织中显著降低(P<0.05)。2.与对照奶牛相比,脂肪肝奶牛肝脏中SIRT1酶活性显著降低(P<0.05)、SREBP-1c的酶活性不显著(P>0.05)、PGC-1α酶活性极显著降低(P<0.01);肝脏中主要调节脂氧化的SIRT1、PGC-1α、ACO基因m RNA的相对表达量极显著降低(P<0.01),蛋白表达极显著降低(P<0.01);PPARα、RXRα、CPT1基因m RNA的相对表达量与蛋白表达均显著降低(P<0.05);CPT2基因m RNA的相对表达量显著降低(P<0.05),蛋白表达极显著降低(P<0.01);Nrf1、TFAM基因m RNA的相对表达量极显著降低(P<0.01),蛋白表达显著降低(P<0.05)。3.OA造模后,与对照组奶牛肝细胞相比,造模组肝细胞内TG、TC的含量显著升高(P<0.05),VLDL的含量升高但不显著(P>0.05)。SIRT1、PGC-1α的m RNA的相对表达量显著降低(P<0.05),对应的蛋白表达极显著降低(P<0.01),SREBP-1c的蛋白表达、m RNA的相对表达量极显著升高(P<0.01)。4.与对照组相比,添加NEFAs组TG、TC的含量极显著升高(P<0.01);添加抗氧化剂NAC的组TG含量显著降低(P<0.05),TC极显著降低(P<0.01);添加NEFAs+NAC组的变化不显著。添加NEFAs组SIRT1的m RNA的表达降低不显著(P>0.05),SIRT1、SREBP-1c的蛋白表达分别显著降低和升高(P<0.05);添加NAC组SIRT1、SREBP-1c m RNA的表达显著(P<0.05),SIRT1、SREBP-1c、PGC-1α基因蛋白表达变化极显著(P<0.01)。5.与对照组比,转染重组过表达SIRT1腺病毒后,调节脂质转运的基因Apo E、LDLR的m RNA表达极显著降低(P<0.01),参与脂氧化的SIRT1、PGC-1α、RXRαm RNA表达极显著升高(P<0.01),PPARαm RNA表达量显著升高(P<0.05),参与脂质合成的SREBP-1c、ACCα基因m RNA表达极显著升高(P<0.01),FAS m RNA表达显著升高(P<0.05);其对应的SIRT1基因及其下游调控的PGC-1α通路的PPARα、RXRα基因蛋白表达显著升高(P<0.05),SREBP-1c、Apo E、LDLR基因蛋白表达显著降低(P<0.05),FAS基因蛋白表达极显著降低(P<0.01),p-ACC基因蛋白表达极显著升高(P<0.01)。结论以上试验结果表明,围产期脂肪肝奶牛体内存在的氧化应激干扰脂质代谢,在氧化应激介导下诱导肝脂沉积,奶牛原代肝细胞脂肪肝模型转染过表达SIRT1基因可通过调控SIRT1-SREBP-1c/PGC-1α通路的方式缓解肝脏脂肪的蓄积。