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H9N2亚型禽流感是一种由H9N2亚型禽流感病毒引起的人畜共患的传染病,在全球范围内广泛传播,严重危害养禽业的发展和人类的健康,而疫苗接种是预防和控制禽流感最为有效的手段。HA蛋白是禽流感病毒表面能够引起机体发生免疫反应的主要抗原,常用其相关指标来衡量疫苗的免疫效力。目前,在H9N2亚型禽流感病毒疫苗生产的上下游过程中,HA血凝法是唯一用于表征病毒总产量的检测方法,但该方法存在精确度低,无法绝对定量等缺陷,同时数据表明该方法的测定结果无法正确反映疫苗的免疫效力。因此,有必要建立H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的定量方法,为疫苗的研发和生产提供相关质量属性指标。本文首先对病毒进行分离纯化。病毒经差速离心澄清后,可在PEG6000终浓度为8%(W/V)和离心力为6000 g的条件下完全沉淀下来。病毒浓缩液经20%～60%(W/V)的连续蔗糖梯度液分离后,病毒主要集中在40%～45%梯度处,经综合鉴定,该处的病毒颗粒形态完整,较为纯净。采用改良型自动收集系统对病毒离心区带进行收集。优化病毒纯化工艺后,最终的HA回收率可达79.6%。其次,采用糖苷酶PNGase F对病毒进行脱糖基处理。结果发现,当病毒蛋白浓度为1000 μg/ml,酶添加量为1/40(v/v)时,便可得到清晰平整且分离良好的病毒蛋白条带。采用Image J软件对脱糖基后的四个主要病毒蛋白条带(NP、HA1、M1和HA2)进行灰度分析后可知HA比例。以该灰度分析法测定三批H7N9全病毒灭活疫苗的HA蛋白含量,所得测定结果与SRID法测定结果的相对偏差不超过10%。最后,采用上述建立的纯化和定量方法对不同培养体系和工艺生产的H9N2亚型禽流感病毒的HA蛋白含量进行分析。结果发现,在相同的HA血凝效价下,不同体系生产的病毒HA蛋白含量存在差异;收获时间、MOI、维持培养基及细胞的代次均会影响病毒HA蛋白含量。通过本文研究,成功建立了一种简单的H9N2亚型禽流感病毒纯化和病毒HA蛋白定量的方法,可为将来H9N2亚型禽流感病毒疫苗的研发和生产提供相关质量属性指标,在保证“质优”的前提下追求高产。