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目的:肾小管间质损害的严重程度直接与肾脏病变的发展速度和预后密切相关,甚至超过了肾小球或肾血管病变本身,肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展至终末期肾功能衰竭的主要病理损害。肾间质纤维化的病理特征之一是肾间质细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)积聚,主要是细胞外基质合成与降解失衡所致,基质金属蛋白酶(matrismetalloproteinases,MMPs)是降解细胞外基质的主要酶系,MMPs活性降低将使细胞外基质分解减少,引起细胞外基质积聚,导致肾纤维化。MMP-2是MMPs中重要成员,其相对分子质量为72000,又称为明胶酶A,能在肾小管上皮细胞表达,可降解多种细胞外基质成分,如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原,纤维连接蛋白等,MMP-2的活性受膜型基质金属蛋白酶-1及其组织抑制剂的影响。
近年研究表明,肾素—血管紧张素—醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteronesystem,RAAS)的激活在肾脏纤维化发生发展中起重要作用,过去一直认为血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是造成肾损害的主要物质,近年研究证实,醛固酮(aldosterone,ALD)在进展性肾损害中发挥重要作用,其具有不完全依赖于AngⅡ的独立作用,特别是在致组织器官纤维化方面,是有丝分裂和胶原合成的强烈刺激剂,可以促进肾脏纤维化,ALD在肾纤维化发生发展中的作用及作用机制逐渐成为研究热点。近来研究表明肾小管间质病变的严重程度比肾小球病变更能决定预后,多种致肾纤维化因素可作用于肾脏,使肾脏局部细胞因子发生变化,从而使MMPs活性下降,ECM分解减少,终致肾纤维化。有研究表明ALD能使肾组织转化生长因子-β1(transforminggrowthfactorbeta1,TGF-β1)表达增加,TGF-β1能使MMP-2表达下降。杨敏等研究发现当结缔组织生长因子(Connectivetissuegrowthfactor,CTGF)和TGF-β1联合刺激鼠肾间质成纤维细胞48小时后,MMP-2活性及蛋白均明显降低,用定量PCR方法检测刺激后转录水平,发现MMP-2mRNA的变化与蛋白质的变化趋向一致,说明CTGF、TGF-β1协同可能影响MMP-2的基因转录水平、蛋白质生成量或者细胞转运、分泌MMP-2等环节,最终使MMP-2活性降低,降解细胞外基质的能力减弱。由此我们推测ALD对体外培养的人近端肾小管上皮细胞MMP-2的表达存在影响。
基于以上研究,ALD对人近端肾小管上皮细胞MMP-2的表达有何影响,是否能减少其表达,促进肾小管间质纤维化的进展,检索国内外文献未见相关报道。因此,本课题利用体外培养的人近端肾小管上皮细胞,研究ALD对肾小管上皮细胞MMP-2的表达及细胞增殖的影响,以探讨ALD在肾间质纤维化中的作用及可能的发病机制,从而为肾纤维化治疗提供新策略。
方法:
1人近端肾小管上皮细胞(HK2)的培养:HK2购自中国协和医科大学细胞中心,使用RPMI1640培养液(含10%小牛血清、100U/L青霉素和100mg/L链霉素),于37℃、5%CO2环境中培养。
2将人近端肾小管上皮细胞分2组:空白对照组及不同浓度(10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)ALD刺激组。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察不同浓度及不同时间ALD对HK2MMP-2mRNA的表达的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察不同浓度的ALD对HK2增殖的影响。
结论:
1ALD能够抑制人近端肾小管上皮细胞MMP-2的表达,促进肾小管上皮细胞增殖,并具有剂量依赖和时间依赖的趋势。
2ALD可能通过抑制人近端肾小管上皮细胞MMP-2的表达,促进肾小管上皮细胞增殖,转化和凋亡,导致细胞外基质积聚,促进肾间质纤维化的进展。