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近年来,各国学者致力于寻找不明原因习惯性流产(unexplainedrecurrentspontaneousabortion,URSA)的易感基因,易感基因的筛选主要集中在与不明原因习惯性流产危险因素相关的基因上。研究发现,除胚胎核型异常外,胎盘动脉栓塞所致的胚胎血供不足、绒毛坏死是自然流产发生的重要原因之一。凝血功能异常是胎盘微栓塞形成的内在原因,血液高凝状态与反复性自然流产的形成密切相关,同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代谢异常是近年发现的血液高凝状态形成的重要原因之一,是动静脉栓塞性疾病的独立危险因素,故同型半胱氨酸代谢相关酶基因成为主要的候选基因之一。蛋氨酸合成酶还原酶(methioninesynthasereductase,MTRR)、N5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)、蛋氨酸合成酶(methioninesynthase,MS)、胱硫醚B-合成酶(cystathionineB-synthase,CBS)是Hcy代谢途径中的重要酶,这些参与Hcy代谢的相关酶的编码基因杂合性和/或纯合性突变,引起相应的酶活性改变,增高或减低血管毒性Hcy水平,从而可能改变不明原因习惯性流产的易感性。尽管这些与Hcy代谢有关的突变可能增加习惯性流产的危险,但遗传因素确切的影响尚未完全清楚,结果仍存在争议。本研究旨在探讨对MTRRA66G、MTHFRC677T、MSD919G、CBS844ins68基因多态性与不明原因习惯性流产的关系,探讨四种基因多态性在URSA发病中有何协同作用;寻找不明原因习惯性流产的易感基因,从分子遗传学角度发现不明原因习惯性流产的高危人群,从而对人群进行筛选,早期对携带易感基因的人群给予干预措施,为找出个体化预防和治疗不明原因习惯性流产的方法提供理论基础。
材料与方法1、研究对象:均为广东地区汉族人,饮食结构相似,各研究对象之间无血缘关系。不明原因习惯性流产组为临床确诊的习惯性流产患者50例;对照组共56例,为年龄与不明原因习惯性流产组相匹配的同期住院的非习惯性流产病例。所有研究对象均除外糖尿病、癌症、肝肾功能不全、甲状腺疾病、接受器官移植、严重营养不良等疾病,并排除近1个月内服用影响血Hcy浓度的药物(如:避孕药、苯妥英钠等抗癫痫药物、多巴胺类药物、叶酸或VitB12等)者。
2、人外周血白细胞DNA的提取:静脉血2ml,EDTA抗凝,采用美国Gentra公司的DNA抽提试剂盒,抽提基因组DNA。
3、MTHFR基因C677T多态性的检测:参照文献设计引物,PCR扩增MTHFR基因后的产物长度为246bp,产物用Hinfl限制性内切酶酶切,用2.5%的琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切后的产物长度。并行基因测序。
4、MTRR基因A66G多态性的检测:参照文献设计引物,PCR扩增MTRR基因后的产物长度为151bp,产物用NdeI限制性内切酶酶切,用3.5%的琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切后的产物长度。并行基因测序。
5、MS基因D919G多态性的检测:参照文献设计引物,PCR扩增MS基因后的产物长度为189bp,产物用HaeⅢ限制性内切酶酶切,用3.0%的琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切后的产物长度。并行基因测序。
6、CBS844ins68基因多态性的检测:参照文献设计引物,PCR反应条件:940C预变性5min,94℃50s,61℃60s,72℃90s,共32个循环。CBS基因扩增产物直接加样行1%琼脂糖凝胶电泳分析,紫外线灯下观察带型并予定型。并行基因测序。
7、统计学分析:用SPSS11.5统计软件进行分析,计算上述4个基因的基因突变率、等位基因频率、基因型频率、基因多态性与疾病的相关性及相对危险度。计量资料组间比较用独立样本t检验,配对t检验和单因素方差分析,计数资料组间比较用x2检验。基因型及等位基因相对风险率以比数比(OddsRatios,OR)及95%可信区间表示,显著水平用x2检验,及Logistic回归分析确定独立危险因素。
结果: 1、MTHFR基因C677T多态性与不明原因习惯性流产的关系:不明原因习惯性流产组与正常对照组之间MTHFR677C→T突变有显著差异(p<0.05),不明原因习惯性流产组677C→T突变纯合子(24.0%)较对照组(7.1%)明显升高。等位基因突变频率习惯性流产组(26.0%)较对照组(17.9%)升高。
2、CBS844ins68基因多态性与不明原因习惯性流产的关系:不明原因习惯性流产组和对照组的CBS基因多态性的分布无显著性差异(p>0.05)。
3、MTRR基因A66G多态性与不明原因习惯性流产的关系:不明原因习惯性流产组和对照组的MTRR基因A66G多态性的分布无显著性差异(p>0.05)。
4、MS基因D919G多态性与不明原因习惯性流产的关系:不明原因习惯性流产组和对照组的MS基因多态性的分布无显著性差异(p>0.05)。
5、MTHFRC677T、MSD919G、MTRRA66G、CBS844ins68复合突变与不明原因习惯性流产的关系:MTHFR/MTRR、MTHFR/MS、MTRR/MS、MTHFR/MS/MTRR、MTHFR/CBS、MS/CBS、MTRR/CBS的各复合基因型在不明原因习惯性流产组和对照组之间的分布无显著性差异(p>0.05)。
结论: 1、MTHFR基因CC型可能对不明原因习惯性流产有一定的保护作用,而TT型可能易患习惯性流产。
2、MTRR基因A66G、MSD919G、CBS844ins68基因多态性和MTHFR/MTRR、MTHFR/MS、MTRR/MS、MTHFR/CBS、MS/CBS、MTRR/CBS、MTHFR/MS/MTRR的各复合基因型在不明原因习惯性流产组和对照组之间的分布无显著性差异。