研究背景： 急性心肌梗死是严重危害中老年人身体健康的常见病、多发病。目前临床缺乏针对病变冠脉、梗死心肌的再造和再生的根本性治疗方法，虽然发病4-6小时内及时溶栓、介入治疗使梗塞相关血管早期持续开通可挽救濒临死亡的心肌细胞，但绝大多数患者就诊时缺血心肌已有坏死，此时再灌注治疗只能防止梗死范围的扩大，而对于已坏死的心肌无效。由于成人心肌组织无分化再生能力，其坏死心肌细胞只能由成纤维细胞取代而形成无收缩功能的瘢痕组织，终致心衰，甚至猝死，严重影响患者生活质量和寿命。细胞移植修复坏死心肌展示出良好的前景。目前研究多集中在胎儿心肌细胞、胚胎干细胞、骨骼肌干细胞、骨髓干细胞移植等等，但由于供体胎儿心肌获取困难，且同胚胎干细胞一样存在着伦理、法律、免疫排斥反应等问题，难以用于临床；骨骼肌细胞同心肌细胞均是横纹肌细胞，通过骨骼肌干细胞移植的方法修复损伤坏死心肌取得了一些进展，但是骨骼肌干细胞数量极少，约占骨骼肌细胞总数的4％-8％，而且与年龄的增长呈负相关，同时，骨骼肌干细胞定位比较分散，不容易分离获得，要想达到移植所需要的细胞数量非常困难。最近研究表明，骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潜能，在适宜的刺激条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞、骨骼肌细胞及成心肌细胞等，此外，MSCs容易获得，易分离培养，体外扩增能力强，并且不表达共刺激抗原B7等。这些特性使得MSCs倍受心血管医学界的关注，有望成为心肌梗死后心肌再生的理想治疗手段。 研究目的： ①优化MSCs的分离、纯化、扩增的方法；②观察成人MSCs在体外能否分化为成心肌细胞；③观察大鼠MSCs在正常模型和梗死模型心脏组织中的迁移分化状况；④了解MSCs进行同种异体移植对大鼠心肌梗死的治疗作第三军医大学博士学位论文用;⑤观察成人MSCs进行异种异体移植对大鼠心肌梗死的治疗效果;⑥探讨成人MSCs分化的成肌细胞移植联合转染VEGF基因对大鼠心肌梗死的治疗意义。期望最终能为心肌梗死治疗提供新的思路、新的途径和新的措施，为干细胞的临床应用奠定基础。方法与结果: 第一部分:探讨了人MSCS的体外分离、纯化、扩增和向心肌细胞的定向诱导分化条件。首先采用密度为1.0739/mL的Percon分离液分离成人骨髓中的单个核细胞，进而获得MSCs，用DMEM一F12+l0%胎牛血清作为基本培养基，通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养，平均每2一3天在细胞达70~80%融合时，传代一次。5.0x 105个原代细胞体外扩增12代后可获得2.3 x 109个细胞，扩增约4.6x 103倍，细胞形态仍保持均一的长梭形。流式细胞仪检测扩增后MSCs表面抗原特性，结果表明MSCs强表达干细胞标记CD29，而不表达造血干细胞特异抗原CD34和淋巴细胞表面抗原CDlla，属非造血干细胞的另一群干细胞。第2、6、11代hMSCs经诱导后7天，相差显微镜下见细胞呈长梭形、多核，10天可见肌管样结构;免疫组化检测发现:第2、6、11代hMSCs诱导后均表达肌钙蛋白I(Tnl)和结蛋白(desmin);RT一PCR显示:诱导后细胞心肌特异因子基因p一肌浆蛋白重链(p一MHC)为阳性表达，其中第6代MSCs的p一MHC表达较第2、11代高。原代培养72h细胞(细胞数量少，密度低)，经诱导后无阳性结果。 结果提示:①及时传代可避免MSCs自身分化，也是纯化MSCs的重要因素之一;②人源MSCs在bFGF辅助下、经5一aza诱导可定向分化为成心肌细胞;③MSCs的数量，及其高纯度、高扩增能力是定向诱导分化为心肌细胞的基本条件。 结论:成功优化人MSCs培养、纯化及扩增条件，证明hMSCs能分化为成心肌细胞。 第二部分:采用结扎左冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗塞模型，体外分离Wistar大鼠骨髓MSCs，扩增及纯化后进行同种异体移植。35只大鼠随机分为四组:①正常心脏+r MSCs移植组(n=10):正常大鼠接受同种异体rMsCs移植治疗(5 x 106 MsCs八00 ul，分4点注入);②急性心肌梗死对照组(n=10):大鼠心肌梗死后注射等量培养基;③心肌梗死+r MSCs移植组(n== 10):大鼠心肌梗死后l一3h接受同种异体:Mses移植治疗(5 x xo6 Mses/1 OOul，分4点注入)。④单个核细胞治疗组(n=5):大鼠心肌梗死后1一3h第三军医大学博士学位论文接受同种异体单个核细胞移植治疗(sxl06MSCs八OOul，分4点注入)。干细胞移植后10周经荧光显微镜观察移植细胞的存活、迁移分布，免疫组化鉴定移植细胞的心肌分化，HE染色观察血管新生。结果:口移植细胞在心肌缺血、梗塞区分布广泛，其细胞核呈椭圆形类似心肌细胞核，并与宿主心肌纤维排列方向一致;口免疫组化鉴定，供体细胞胞浆心肌特异蛋白染色阳性;口HE染色观察，梗死边缘区心肌面毛细血管数目明显增加(5.37土o.svs1·24士0.3，p<O，01);口在正常心脏微环境中，供体MSCs呈小岛屿状分布，没有迁移现象，与宿主心肌纤维排列方向无关，免座且化检测胞浆心肌特异蛋白染色阴性;⑤移植DAPI标记的同种异体单核细胞，10w后在梗死大鼠心脏未见存活供体细胞。 结果提示:①及时传代可避免