目的:女性生殖系统恶性肿瘤严重威胁女性生命健康,卵巢癌是其中死亡率最高恶性肿瘤。卵巢癌是一种很难早期发现和早期诊断的疾病,70%的患者确诊时已属晚期^[1]。目前虽然卵巢癌在治疗方面有了很大的提高,相关靶向药物已经应用于临床,但其5年生存率仍徘徊于25～45%^[2]。主要原因可能是卵巢有较高的复发率、较强的化疗耐药能力、免疫逃逸能力、较高的转移率等。因此卵巢癌的发生发展机制一直是妇科肿瘤基础与临床研究的重点,寻找高效、特异的肿瘤标记物及有效的药物作用靶点,对于卵巢癌的诊断及疾病进展监测十分重要。人附睾蛋白4（Human Epididymis Protein 4,HE4）,最初在附睾上皮细胞中检测到其特异性表达于而得名^[3]。有研究者利用基因组分析比较,发现HE4在卵巢癌中高表达^[4],随后有研究者^[5]通对2607个项目进行Meta分析发现,HE4在卵巢癌的诊断和疾病进展监测中具有更高的敏感性和特异性,其阳性似然比、阴性似然比均优于CA125,且HE4在良性疾病中的阳性表达率低于CA125,均证明其在卵巢癌的诊断方面的优势地位。2003年HE4被指定为卵巢癌的血清标志物^[6];2009年HE4被FDA批准用于监测上皮性卵巢癌的复发和进展^[7]。HE4是一种分泌型蛋白,因此目前的研究多局限于血清监测,但有关HE4功能及机制方面的研究较少。本课题组前期利用临床病理标本和卵巢癌细胞系已经证明:HE4在卵巢癌组织及血清中高表达,并证明了HE4与膜联蛋白A2是相互作用蛋白,可以促进卵巢癌细胞的侵袭、转移等恶性生物学行为,可能是通过激活MAPK等信号通路等机制实现^[8-9]。课题组前期利用酵母双杂交方法,以HE4为诱饵,在cDNA文库中筛选,基因测序分析,得到YWHAE蛋白。YWHAE蛋白（即14-3-3ε蛋白）,属于14-3-3蛋白家族中的一员,该家族在蛋白质相互作用中发挥桥梁作用,可以广泛与其他蛋白质如激酶、磷酸酶、跨膜受体和转录因子等靶蛋白结合^[10-13]。YWHAE作为一种中间蛋白与可以多种靶蛋白结合,调节肿瘤细胞生长、迁移、转移、细胞周期、细胞凋亡及参与信号转导通路,进而影响肿瘤的发生发展。在肿瘤相关研究中,已经证明YWHAE在肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、食管癌中均呈高表达,但具体机制仍不十分清楚^[14-18]。随着基因检测技术和生物信息学的发展,有报道在卵巢癌化疗前后及合并糖代谢异常患者血清中YWHAE存在表达差异^[19-20],但在人上皮性卵巢肿瘤中的表达情况及作用机制的实验研究尚未见报道。本研究在前期工作基础上,探讨YWHAE与HE4两者的关系、YWHAE在卵巢组织中的表达情况以临床意义;构建YWHAE差异表达细胞模型,探讨YWHAE对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响;探索YWHAE激活的下游通路,从而为进一步探究卵巢癌的发生、发展机制以及寻找卵巢癌新的治疗靶点提供理论依据。研究方法:1、本研究首先通过免疫共沉淀、Western Blot方法检测YWHAE和HE4的相互作用关系,荧光共聚焦方法检测YWHAE和HE4在细胞中的定位关系。选择盛京医院妇产科2008年到2012年手术切除的石蜡标本163例,其中正常组16例（来源于因子宫肌瘤或宫颈癌而切除的正常卵巢组织标本）,良性组18例,交界性组24例,恶性组105例。利用免疫组化方法,检测YWHAE蛋白的表达水平,并分析YWHAE表达与临床病理参数的关系。进一步分析YWHAE和HE4在相同卵巢癌组织中的表达相关性。通过对105例上皮性卵巢癌患者进行随访并收集信息,分析YWHAE的表达对患者预后的影响。2、利用慢病毒分别构建YWHAE稳定高表达细胞系OVCAR3-YWHAE-H及其对照细胞系OVCAR3-YWHAE-Mock,A2780-YWHAE-H及其对照细胞系A2780-YWHAE-Mock;利用小干扰RNA分别构建YWHAE低表达细胞系CAOV3-YWHAE-L及其对照细胞系CAOV3-YWHAE-Mock,ES2-YWHAE-H及其对照细胞系ES2-YWHAE-Mock。通过Transwell试验检测差异表达YWHAE前后细胞的侵袭能力和EMT能力,划痕试验检测差异表达YWHAE前后细胞的迁移能力。MTT检测差异表达YWHAE前后细胞增殖能力,流式细胞实验检测差异表达YWHAE前后细胞周期和凋亡的变化。裸鼠瘤组织标本免疫组织化学检测p-AKT与p-ERK蛋白的表达情况。3、通过Western Blot方法检测差异表达YWHAE前后,PI3K/AKT和MAPK信号通路节点蛋白的变化,应用Transwell试验检测添加PI3K和MAPK通路抑制剂后差异表达YWHAE细胞侵袭能力的变化,划痕试验检测添加PI3K和MAPK通路抑制剂后差异表达YWHAE细胞迁移能力的变化,MTT实验试验检测添加PI3K和MAPK通路抑制剂后差异表达YWHAE细胞增殖能力的变化。结果:1、本研究通过免疫共沉淀、荧光共聚焦方法证明了YWHAE和HE4存在相互作用,且存在共定位关系。免疫组化实验证明YWHAE在卵巢恶性组中的阳性表达率、强阳性率均明显高于交界性组、良性组和正常组,临床病理参数分析提示FIGO III-IV期卵巢癌患者YWHAE高表达率明显高于FIGO I-II期卵巢癌患者,且YWHAE高表达的患者预后不佳,相关性分析提示YWHAE的表达与HE4的表达呈正相关。2、高表达YWHAE的肿瘤细胞侵袭能力、迁移、上皮间质转化能力明显增强,低表达YWHAE前后肿瘤细胞侵袭、迁移、上皮间质转化能力明显减弱。YWHAE蛋白高表达的肿瘤细胞,G2/M期细胞的比例明显升高,凋亡细胞比例明显减少,体外肿瘤细胞增殖能力明显增强。证明YWHAE可增强卵巢癌细胞的侵袭、迁移、增殖、抑制凋亡等恶性生物学行为。裸鼠成瘤实验发现,YWHAE高表达组细胞的移植瘤质量和移植瘤体积均明显大于YWHAE空转对照组;裸鼠瘤组织免疫组化结果显示YWHAE高表达组中p-AKT与p-ERK蛋白的表达强度高于对照组。3、过表达YWHAE的细胞系中PI3K/AKT通路节点蛋白（PI3K/AKT/m-TOR）和MAPK通路节点蛋白（MEK/ERK）磷酸化比例较对照组明显增加。添加PI3K和MAPK通路抑制剂后,过表达YWHAE组的卵巢癌细胞侵袭、迁移和增殖能力明显降低。结论:1、本研究证明了YWHAE和HE4存在相互作用,且存在共定位关系。YWHAE在卵巢癌组织中表达明显增高,是卵巢癌预后的危险因素,且与HE4的表达呈正相关。2、YWHAE可以促进卵巢癌细胞侵袭、迁移、增殖、抑制凋亡等恶性生物学行为。3、YWHAE可通过PI3K/AKT和MAPK信号通路促进上皮性卵巢癌细胞的侵袭、迁移和增殖能力。