研究背景:脓毒症是指因感染引起的宿主反应失调导致危及生命的器官功能障碍,是重症监护室（Intensive Care Unit,ICU）中最为常见与凶险的一种疾病,因其死亡率高,所以一直是危重症医学面临的重要临床问题。目前普遍认为脓毒症的发病机制是感染后由细菌内毒素（Lipopolysaccharide,LPS）引起失控的炎性反应、免疫功能紊乱、高代谢状态以及多器官功能损害。单核/巨噬细胞在脓毒症的发生发展中起到了关键作用。LPS能够刺激单核/巨噬细胞释放大量以肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）为主的炎症因子,而TNF-α又通过其下游肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（Tumor necrosis factor receptor typeⅠ,TNFR1）发挥炎症作用,超过TNF-α与肿瘤坏死因子Ⅱ型受体（Tumor necrosis factor receptor typeⅡ,TNFR2）结合后抑制炎症和维持免疫平衡的作用,随后联合多种炎症因子造成炎症风暴并迅速级联扩大引起全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome,SIRS）和多器官功能损害（Multiple organ dysfunction syndrome,MODS）。到了脓毒症中后期主要表现为过度的免疫抑制,机体逐渐进入免疫失衡状态。炎症介质过度释放所致的炎症风暴及免疫失衡被认为是介导脓毒症性器官损伤、诱发MODS,从而造成患者死亡及预后不良的主要机制。此外,免疫失衡这一过程又主要与TH17和Treg细胞相关,在脓毒症早期TH17细胞占据主导,以炎症为主;后期炎症因子的过量表达超过机体调节能力,加上Th17细胞消耗过度,Treg细胞开始占据主导,出现免疫抑制和免疫麻痹,加重感染。在脓毒症的治疗过程中,尚缺乏有效预防和控制的药物和方式。能够抑制脓毒症病程早期的关键促炎细胞因子,在炎症风暴来临前阻止炎症的爆发,调节免疫平衡对脓毒症的治疗是至关重要的。多种证据表明,TNF-α就是脓毒症发病过程中炎症早期最主要的促炎细胞因子。TNF-α是一种具有多种生物活性的细胞因子,TNF-α及其受体TNFRs在机体炎症反应和免疫调节过程中发挥着关键的作用,一直是炎症性疾病或自身免疫性疾病发病机制研究和药物设计的重要靶点。目前的临床治疗以英夫利昔单抗（Infliximab,IFX）和阿达木单抗（Adalimumab）为代表的单抗类药物在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）和类风湿性关节炎（Rheumatic arthritis,RA）等疾病的治疗中获得了巨大成功,进一步证明阻断TNF-α是一种有效的治疗手段。然而,这类抗TNF-α单抗药物因完全封闭了TNF-α的生物学功能,导致影响机体的免疫自稳、免疫监视功能,给很多患者带来了易发生结核病感染、产生新的自身免疫疾病甚至诱发肿瘤的毒副作用。从抗炎角度,TNF-α主要是通过其受体TNFR1发挥促炎作用,受体TNFR2发挥反馈调节作用。通过选择性地阻断TNFR1传递的信号通路来封闭TNF-α的生物学功能,中和TNF-α的促炎活性,同时维持TNFR2介导的有利的免疫反应（包括免疫调节、组织稳态和神经保护）已成为该类药物研发的热点。因此,以TNFR1为药物靶点,特异性、专一性抑制其炎症功能从而抑制炎症风暴,同时开放TNF-TNFR2通路维持免疫平衡,对于脓毒症的预防和治疗可能具有重要意义。本课题组前期研究中,以TNFR1为特异性靶点淘选青环海蛇毒腺噬菌体展示文库,获得了一种靶标特异的蛇毒活性肽Hydrostatin-SN10（以下简称SN10）。该抗炎肽在IBD和RA小鼠模型的治疗当中取得了良好的效果,且其适应症——IBD的临床前研究及Pre-IND都已完成。由于SN10能够选择性、专一性的结合TNFR1,封闭TNF-TNFR1通路,同时开放TNF-TNFR2通路维持免疫平衡,可能对脓毒症的治疗具有重要作用。本课题拟利用体外细胞炎症模型和脓毒症动物模型,开展SN10治疗脓毒症的药效学及机制研究,完善SN10的临床前研究数据。研发SN10成为具有明确靶点的、海洋来源的First in Class创新新药奠定基础。研究目的:1、利用LPS诱导的骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophage,BMDM）和RAW 264.7细胞建立两种炎症细胞模型,探讨多肽SN10的抗炎活性及其作用机制;利用Tnfr1-/-和Tnfr2-/-小鼠BMDM细胞模型验证SN10对靶点TNFR1的专一选择性;2、利用盲肠穿刺结扎法（Cecal ligation and puncture,CLP）及LPS腹腔注射法建立C57BL/6小鼠脓毒症疾病模型,探讨SN10治疗脓毒症的药效学及其作用机制;利用Tnfr1-/-和Tnfr2-/-基因敲除动物模型验证多肽SN10对靶点TNFR1的专一选择性。这将对研发选择性TNFR1拮抗肽SN10成为具有自主知识产权的、临床急需的、我国特色的First-in-Class海洋创新药物具有重要意义。研究方法:一、Hydrostatin-SN10的体外抗炎效应及作用机制研究1、利用1μg/ml LPS诱导建立RAW 264.7细胞和野生型（Wild-type,WT）C57BL/6小鼠的BMDM炎症细胞模型,根据前期预实验结果,阳性对照组英夫利昔单抗（IFX,TNF-α单抗）给药浓度为0.55μM（分子量约144.19KD,浓度约为80μg/ml）,实验组SN10给药浓度为25μM、50μM和100μM（SN10分子量约1.25KD,浓度约为31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml）,探讨SN10在两种炎症细胞模型中的体外抗炎效果及其作用机制。（1）通过Griess试剂、RT-PCR和流式细胞术检测造模24 h时炎症因子NO和6h时炎症因子IL-6、TNF-α、IL-10等表达水平,评价SN10的抗炎效应;（2）Western blot检测造模6 h时TNFR1下游通路中ERK、JNK、P65、p38、iκB蛋白的磷酸化水平,以及免疫荧光技术观察核转录因子（NF-κB）的核定位情况,探讨SN10的抗炎分子机制。2、利用1μg/ml LPS诱导的WT、Tnfr1-/-和Tnfr2-/-C57BL/6小鼠的BMDM模型,探讨SN10对不同基因型炎症细胞模型的作用,确证SN10对靶点TNFR1的选择性及其机制。二、Hydrostatin-SN10治疗脓毒症的药效学及作用机制研究1、利用CLP和LPS腹腔注射两种方法构建脓毒症动物模型,研究SN10治疗脓毒症的体内效应和作用机制。（1）重度造模（CLP结扎程度75%;LPS 15 mg/kg）,连续观察7 d,判断不同浓度SN10对脓毒症小鼠生存率的影响,筛选最适药物浓度,并从整体上评价其对脓毒症的效应;（2）中度造模（CLP结扎程度50%;LPS 10 mg/kg）,24 h取材,通过检测外周血中单核细胞绝对数、血清中TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-10等炎症因子的表达水平以及ALT、AST、BUN、Cr和α-AMS脏器功能指标,并用HE染色分析肺、肝、肾、脾多器官组织病理损伤共同评价800μg/kg SN10对脓毒症炎症风暴作用及对脓毒症小鼠多脏器的保护作用。通过免疫组织化学方法分析脾脏组织中Treg细胞的表达和Western blot分析TNFR1下游炎症相关信号通路的活化,揭示SN10的体内抗炎机制。2、构建CLP重度造模诱导的Tnfr1-/-和Tnfr2-/-基因敲除C57BL/6小鼠脓毒症模型,使用IFX和不同浓度SN10进行腹腔注射治疗,验证SN10在体内水平的靶点选择性,从而深入探究SN10通过选择性拮抗TNFR1靶标治疗脓毒症的作用机制。研究结果:一、Hydrostatin-SN10的体外抗炎效应及作用机制研究1、SN10能够显著抑制LPS刺激的RAW 264.7炎症细胞模型中NO、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达以及TNFR1通路关键蛋白P65、IκB、JNK、ERK、P38的磷酸化和NF-κB的核定位。2、SN10能够显著抑制LPS刺激的WT和Tnfr2-/-BMDM炎症细胞模型中NO、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达以及TNF-TNFR1下游NF-κB和MAPK信号通路的关键蛋白磷酸化;而在Tnfr1-/-BMDM炎症细胞模型中,SN10无明显的抑制作用。二、Hydrostatin-SN10治疗脓毒症的药效学及作用机制研究1、在CLP及LPS诱导的WT C57BL/6小鼠重度脓毒症模型中,SN10处理组生存率明显提高,800μg/kg SN10组效果最佳。2、SN10能够抑制脓毒症小鼠外周血中单核细胞绝对数、血清生化指标（AST、ALT、CRE、BUN、α-AMS）以及IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-17等炎症因子的表达,同时提高IL-10等抑炎因子的表达;HE染色结果表明:模型组可见各脏器炎症细胞浸润明显,结构有不同程度的破坏,甚至出现组织坏死的情况,SN10组和IFX组可见炎性细胞浸润明显减轻,组织破坏程度降低,且SN10治疗效果优于IFX;脾脏免疫组化结果表明:与模型组相比,SN10组中Foxp3的表达量显著升高,IFX组升高相对不明显;Western-blot实验结果显示:与模型组相比,SN10和IFX能够显著抑制IκB、JNK、ERK和P38的磷酸化,且SN10的抑制效果优于IFX。3、在CLP诱导的Tnfr2-/-C57BL/6小鼠重度脓毒症模型中,SN10组生存率明显升高,800μg/kg组效果最佳,生存率达到62.5%（p＜0.001）,效果远超IFX组（25%）;在Tnfr1-/-C57BL/6小鼠脓毒症模型中,SN10和IFX对小鼠生存率都没有明显的提高。结论:1、选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10在体外水平能够有效抑制NO、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达从而发挥抗炎作用,其作用机制是抑制TNFR1下游NF-κB通路和MAPK通路的关键蛋白磷酸化;确证了Hydrostatin-SN10对靶点TNFR1具有专一选择性。2、选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10对脓毒症疾病动物模型具有显著的抗炎效应,能够阻止炎症风暴的发生,降低器官的损伤程度,其作用机制是“选择性封闭TNF-TNFR1信号通路,阻断炎症风暴;开放TNF-TNFR2信号通路,调节Th17/Treg,维持免疫平衡”。这为研发Hydrostatin-SN10成为具有自主知识产权的、治疗脓毒症临床急需的海洋创新药物奠定了基础。