喉癌(Laryngeal cancer)是头颈部常见的恶性肿瘤之一,其发病率正在逐年上升,在东北地区喉癌能占到所有肿瘤的5.7%-7.6%。喉癌目前的治疗包括手术和放化疗、生物治疗等多种治疗手段有机的结合。但是患者的生存并没有得到很大的改善,肿瘤的复发及转移是患者治疗失败的主要原因。近年来,肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)理论的提出为肿瘤转移的研究提供了新的视角,CSCs的理论认为CSCs是存在于肿瘤内的极少数细胞,充当干细胞的角色,并具有自我更新、多向分化、高致瘤及高转移性的特性,是肿瘤的起源。目前CSCs的研究已经有了很大的进展,在白血病以及多种实体瘤中包括喉癌中都分离出了CSCs。在本研究中,我们从CSCs的角度去分析肿瘤转移可能的来源与机制。由于CSCs对多种化疗药物耐药,产生抵抗,目前许多化疗药物对喉癌的治疗并不十分理想。所以寻求新的抗肿瘤药物是非常必要的。以前的研究发现,广泛用于临床的抗疟药物双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)是从青蒿素中提取的倍半萜内酯类物质的衍生物,可以抑制多种肿瘤包括头颈肿瘤的生长,具有安全、高效、副作用小等优点。但DHA对喉癌侵袭、转移是否具有抑制作用及机制目前仍不清楚。所以,我们针对这两大问题展开研究,通过体外和在体实验探讨介导喉癌侵袭、转移的主要细胞及其DHA对喉癌的侵袭和转移是否有抑制作用及其可能的机制。第一部分喉癌CSCs的分离及其体外侵袭和迁移能力的研究目的:比较喉癌Hep-2细胞系CD133~+与CD133~-细胞在侵袭转移能力方面的差别,并探讨其存在差异的机制。方法:1用流式细胞分选技术分离出细胞表面标记CD133~+及CD133~-的喉癌Hep-2细胞,分别培养后再检测阳性细胞中CD133的阳性表达率。2应用Transwell小室这项技术检测两种细胞侵袭和转移能力的差异。3 Westen blot检测两种细胞侵袭转移相关蛋白MMP-9、E-cadherin的表达情况。结果:1流式细胞分选的结果:PE标记的CD133抗体染色后,流式细胞检测显示喉癌Hep-2细胞表面CD133的阳性表达率为3.4±0.559%,无血清培养一周后再经流式检测CD133~+纯度测定为86.5±3.011%。2 Transwell小室检测结果显示:两种细胞在traswell小室的上室培养24小时后,与CD133~-细胞相比,CD133~+细胞显示出更强的侵袭、迁移能力(P<0.01)。3 Western blot结果:侵袭转移相关蛋白MMP-9在CD133~+细胞中的相对表达量为(0.87±0.016)明显高于CD133~-细胞(0.643±0.011),使用T检验的方法检测两组之间的蛋白相对表达量,两者之间有显著的统计学差异(t=20.08,P<0.01)。另一种侵袭转移相关联的蛋白E-cadherin与MMP-9相反,在CD133~-细胞中的表达量明显高于CD133~+细胞,两种细胞中该蛋白的表达量分别为CD133~+(0.376±0.0200),CD133~-(0.791±0.015),T检验检测两组之间的差异有统计学意义(t=28.49,P<0.01)。结论:1 CD133~+喉癌细胞较CD133~-细胞的侵袭迁移能力更强,可能是在肿瘤侵袭、转移中的主要责任细胞。2 CD133~+细胞的高侵袭性可能与CD133~+细胞自身表达更多的侵袭转移相关蛋白MMP-9以及丢失粘附蛋白E-caherin有关。第二部分DHA通过抑制STAT3信号途径干扰喉癌CSCs的侵袭和迁移作用的研究目的:观察DHA抑制喉癌干细胞侵袭转移的作用,并探讨其作为潜在的STAT3抑制剂对STAT3所激活的侵袭转移相关信号通路的阻断作用。方法:1将流式分选出的CD133~+细胞根据培养条件的不同分为4组:(1)无血清培养,不添加任何药物及激活或干扰因子(对照组);(2)在(1)的基础之上加入细胞因子IL-6(20ng/ml);(3)先加入IL-6作用1h,然后再加入DHA;(4)在(1)的基础上只加入药物DHA。同理,用另外一个条件低氧进行干预也分为4组:(1)单纯的无血清常氧培养;(2)无血清低氧培养;(3)低氧培养的同时加入DHA;(4)无血清常氧培养再加入DHA。2用Transwell小室技术检测上述不同培养条件下CD133~+细胞的侵袭转移数量的变化。3 Western blot检测上述不同条件(IL-6和低氧)激活STAT3,以及再加入DHA后,HIF-1α(乏氧条件下),STAT3,p-STAT3以及侵袭转移相关蛋白MMP-9、E-cadherin的表达情况。结果1 Transwell结果:(1)在IL-6和/或DHA外加因素作用后,喉癌干细胞转移的结果显示:未处理组即对照组(162±13)个/HP,IL-6组(310±13)个/HP,IL-6+DHA组(57±9)个/HP,DHA组(48±6)个/HP。应用单因素方差分析检测四组之间的差异有统计学意义(F=1184,P<0.01),应用Tukey’s multiple comparison test方法比较组内两两的差别,IL-6组和对照组相比(q=41.92,P<0.01),IL-6组和IL-6+DHA联合组比较(q=71.28,P<0.01),对照组和DHA组相比较(q=32.06,P<0.01)。四组喉癌干细胞侵袭的结果:对照组(107±3)个/HP,IL-6组(204±7)个/HP,IL-6+DHA组(44±7)个/HP,DHA组(30±7)个/HP方差分析四组之间的差异均有统计学意义(F=1453,P<0.01),IL-6组和对照组相比(q=46.68,P<0.01),IL-6组和IL-6+DHA联合组比较(q=76.79,P<0.01),对照组和DHA组相比较(q=37.11,P<0.01)。(2)在低氧和/或DHA作用后,各组喉癌干细胞经Traswell转移的结果示:常氧组(137±9)个/HP,低氧组(229±7)个/HP,低氧+DHA组(59±4)个/HP,常氧+DHA组(39±5)个/HP。四组之间单因素方差分析结果显示四组之间的差异有统计学意义(F=1675,P<0.01),各组之间的比较如下:常氧组和低氧组(q=43.68,P<0.01),低氧组和低氧+DHA组(q=80.57,P<0.01),常氧组和常氧+DHA组(q=46.32,P<0.01)。四组细胞Transwell侵袭的结果示:常氧组(122±10)个/HP,低氧组(190±7)个/HP,低氧+DHA(58±6)个/HP,常氧+DHA(39±7)个/HP,四组之间比较经统计学分析四组之间的差异有统计学意义(F=705.9,P<0.01),常氧组和低氧组(q=26.35,P<0.01),低氧组和低氧+DHA组(q=51.35,P<0.01),常氧组和常氧+DHA组(q=32.19,P<0.01)。2 Western blot结果:(1)在IL-6和/或DHA作用于喉癌干细胞后,Western blot检测相关蛋白p-STAT3,STAT3,以及侵袭转移相关蛋白MMP-9,E-cadherin在四组中的表达量的变化,使用单因素方差分析对结果统计。STAT3在四组中的表达量无明显差别,无统计学意义(P>0.05)。p-STAT3在四组中表达量的差异有统计学意义(F=10190,P<0.01),组内两两之间进行比较,IL-6作用后较对照组的表达量增加(q=20.87,P<0.01),加入DHA后,IL-6+DHA组较IL-6组的蛋白量又明显减少(q=183.5,P<0.01),与照组相比该蛋白在DHA组的表达量也明显下降(q=165,P<0.01)。MMP-9的表达趋势变化与p-STAT3相似,四组之间的差异同样有统计学意义(F=7830,P<0.01),四组之间进行比较,在IL-6组表达最多,与对照组相比有统计学意义(q=51.5,P<0.01),而IL-6+DHA组与IL-6组相比,MMP-9的表达量明显下降(q=143.7,P<0.01),单独加DHA与对照组相比也明显下降了(q=232.9,P<0.01)。E-cadherin的变化趋势则与上述两种蛋白相反,四组之间的差异仍有统计学意义(F=1219,P<0.01),IL-6作用后表达量反而降低,与对照组相比差异有统计学意义(q=9.845,P<0.01)。该蛋白在IL-6+DHA组较IL-6组的表达水平明显升高,差异明显,有统计学意义(q=59.85,P<0.01)。DHA单独组和对照组比较,E-cadherin的表达水平升高差异也有统计学意义(q=59.53,P<0.01)。(2)喉癌干细胞低氧和/或DHA作用后,Western blot检测相关蛋白乏氧因子-1α(HIF-1α),p-STAT3和STAT3以及侵袭、转移相关蛋白MMP-9和E-cadherin的表达量变化。用单因素方差分析对结果进行统计、评定。HIF-1α在四组中的表达的差异同样有统计学意义(F=350.9,P<0.01)。低氧培养后,HIF-1α的表达量明显升高,与对照组相比有统计学意义(q=28.32,P<0.01)。加入DHA后其表达量显著下降,低氧+DHA组比低氧组明显减少(q=8.26,P<0.01),且DHA组和对照组比较表达量也显著降低(q=12.80,P<0.01)。p-STAT3和MMP-9的表达趋势与HIF-1α相似,四组之间的差异也有统计学意义(F=2187,P<0.01,p-STAT3;F=4833,P<0.01,MMP-9),在低氧培养后均升高,表达量与相应的对照组比较均有统计学意义,p-STAT3(q=34.68,P<0.01),MMP-9(q=45.31,P<0.01)。同样,在加入DHA后,与相应的对照组比较,这两种蛋白的表达量显著下降,差异有统计学意义,常氧组和常氧+DHA组相比p-STAT3(q=63.68,P<0.01),低氧和低氧+DHA组相比p-STAT3(q=90.30,P<0.01),常氧组和常氧+DHA组相比MMP-9(q=115.7,P<0.01),低氧组和低氧+DHA组比较MMP-9(q=99.39,P<0.01)。STAT3在四组的表达水平无明显差异(P>0.05)。E-cadherin在四组中的差异也有统计学意义(F=17730,P<0.01)。低氧条件下较常氧时表达增高,差异有统计学意义(q=8.848,P<0.01)。而加入DHA后其相应的对照组E-cadherin的表达水平呈现升高的趋势,差异有统计学意义,常氧组和常氧+DHA组比较(q=258.7,P<0.01),低氧组和低氧+DHA组比较(q=196.1,P<0.01)。结论:1 IL-6和低氧的作用可以提高喉癌干细胞的侵袭、迁移能力。2 DHA可以抑制喉癌干细胞的侵袭和转移,其机制可能与DHA特异性的抑制p-STAT3的激活,从而使得其下游的侵袭转移相关蛋白的表达受到影响。第三部分人喉癌Hep-2细胞系的CD133~-和CD133~+细胞在体内侵袭和转移能力的对比研究目的:比较CD133~-和CD133~+细胞在体内的侵袭、转移的差异,并检测侵袭、转移相关蛋白的表达,分析可能的机制。方法:1将裸鼠随机分为2组,分别通过尾静脉注射CD133~-和CD133~+细胞建立转移模型。观察小鼠的一般情况,并记录小鼠生存时间。2对各组肺组织HE染色,观察并计数各组肺组织所形成的转移灶数目。3 Western blot检测两组肺转移灶中侵袭、转移相关蛋白的表达情况,分析可能的机制。结果:1小鼠的一般情况:我们所建立的小鼠的侵袭、转移模型对小鼠的一般情况影响较大,尾静脉注射肿瘤细胞后随着时间延长肺转移灶逐渐形成的过程中,一部分小鼠的体重出现了相应的变化,在生长期出现了体重下降。CD133~-细胞组的小鼠在第31天有2只开始出现体重下降,第33天有3只开始出现体重下降。CD133~+细胞组的小鼠在第19天有3只,第21天有2只,29天有1只小鼠开始出现体重逐渐下降。在体重下降后,小鼠的活动、精神状态等也逐渐开始减低。但两组体重之间的差异无统计学意义。2 CD133~-和CD133~+细胞分别建立的转移模型中肺转移的情况的比较:CD133~-细胞组肺组织转移程度较轻,肉眼观察肺组织红润,表面光滑,而CD133~+细胞组的肺组织表面可见明显转移结节形成,肺组织略显苍白。经HE染色后,镜下观察两组肺组织,与CD133~-细胞组相比,CD133~+细胞组肺转移灶明显较大,且数量多。经T检验两组肺转移灶数目有统计学差异(t=2.615,P<0.05)。3比较CD133~-和CD133~+细胞在体内所建立的肺转移模型对小鼠生存的影响:CD133~-细胞组小鼠在尾静脉注射细胞后第34天、36天分别有1只小鼠出现毫无征兆的死亡,生存率分别为85.71%和71.43%。在第39天有3只小鼠突然出现死亡,最终生存率为28.57%。按照执行安乐死及实际死亡小鼠进行计算,CD133~+细胞组在第29天,31天和34天分别有1只小鼠死亡,生存率分别下降为85.71%,71.43%和57.14%。第39天有3只小鼠死亡,最终生存率为28.57%。应用Kaplan-Meier法对数据进行整理分析,Log-rank test方法对两组生存情况进行比较,得出P>0.05,两组之间生存的差异没有统计学意义。4 CD133~-和CD133~+细胞组转移瘤在侵袭、转移相关蛋白表达的比较:实验结束后,Western blot检测转移瘤中侵袭转移相关蛋白的表达,结果:p-STAT3在两组中的表达有明显的差别,CD133~+细胞组的相对表达量为1.70±0.05,明显高于CD133~-细胞组(0.83±0.30),经T检验,两组之间的差异有统计学意义(t=4.879,P<0.01)。而STAT3在两组之间的表达量无明显差异。侵袭相关蛋白MMP-9在两组转移瘤中的相对表达量也有明显的差异,CD133~+细胞组为1.74±0.51,明显高于CD133~-细胞组(0.47±0.15),两组的差异有统计学意义(t=4.168,P<0.05)。另一种转移相关蛋白E-cadherin在两组之间的相对表达水平则与MMP-9相反,CD133~+细胞组为0.86±0.14,明显低于CD133~-细胞组,两组之间的差异有统计学意义(t=4.241,P<0.05)。结论:1与CD133~-细胞相比,CD133~+细胞更易在体内发生侵袭、转移,我们推测CD133~+细胞可能是介导肿瘤侵袭、转移的主要细胞。2 CSCs中STAT3的组成性激活可以导致下游侵袭、转移相关蛋白MMP-9的表达增高,E-cadherin的表达降低,使细胞获得更强的侵袭和转移的能力。第四部分DHA对喉癌CSCs侵袭和转移的影响及其机制的在体实验研究目的:检测DHA对肿瘤侵袭、转移的抑制作用,并通过检测侵袭、转移相关蛋白表达的变化,探究可能的机制。方法:1将14只BALb/c雄性裸鼠均经尾静脉注射CD133~+细胞建立体内转移模型。将裸鼠随机分为2组,对照组和实验组。实验组给予DHA(100mg/Kg),对照组给予DMSO。观察并记录小鼠的一般情况以及小鼠的生存时间。2对两组小鼠的肺组织进行HE染色,观察并计数两组所形成的肺转移灶。3应用Western blot检测两组小鼠肺转移灶中侵袭、转移相关蛋白的表达情况,并分析DHA对小鼠体内侵袭转移影响的可能机制。结果:1小鼠的一般情况:对照组的小鼠分别在第9天、17天、25天,分别有1只小鼠开始出现体重下降,另2只均在第53天开始出现体重下降,其中1只在第59天体重下降了25%。另外1只小鼠虽然体重下降未达到原体重的20%,但出现反应迟钝、跛行、退缩等反应。实验组有1只小鼠在第23天突然出现体重下降,精神欠佳等。两组之间体重的差异无统计学意义。2 DHA可以抑制肺部转移灶的形成:实验结束后,对比观察两组的肺组织,对照组肺组织颜色苍白,表面有大量的转移灶,而实验组肺组织颜色红润,肺表面转移灶明显少于对照组。对肺组织进行HE染色,并对两组肺部所形成的转移灶分别进行计数和统计学分析,得出两组差异有统计学意义(t=2.940,P<0.05)。3应用DHA后对小鼠生存的影响:对照组在第12天、24天、29天分别出现1只小鼠死亡,生存率分别下降为85.71%,71.43%,57.14%。第59天有2只小鼠死亡,最终生存率为28.57%。而实验组仅在第29天出现1只小鼠死亡,其余小鼠精神状态及饮食情况未见明显变化,均存活至少59+天,总生存率为85.71%。Kaplan-Meier法对两组的生存情况进行整理分析,并用Log-rank test方法对两组的生存进行比较,得出实验组的生存率明显高于对照组(P<0.05)。4 DHA的应用对肿瘤侵袭、转移相关蛋白的影响:我们通过Western blot方法分析两组肺转移灶侵袭、转移相关蛋白的表达情况。P-STAT3在实验组的相对表达量(0.235±0.059)明显低于对照组(1.063±0.222)。经T检验,两组的表达水平差异明显(t=6.248,P<0.01)。STAT3在两组中的表达量无明显差异。侵袭相关蛋白MMP-9在实验组的表达水平为0.300±0.033,明显低于对照组(0.926±0.289)。两组之间的差异有统计学意义(t=3.731,P<0.01)。而转移相关蛋白E-cadherin在加入DHA后的表达水平为(1.305±0.319),显著高于对照组(0.737±0.138)。结论:1 DHA可以显著抑制肿瘤在体内的侵袭、转移,与对照组相比,DHA还能显著提高小鼠的生存时间。2 DHA可能是通过抑制STAT3的磷酸化而使得其下游的侵袭和转移相关蛋白MMP-9的表达下降,E-cadherin表达上调,从而达到抑制肿瘤侵袭、转移的目的。