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类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种慢性进行性的自身免疫性炎症疾病,其主要症状是关节和软骨发炎进而伴随关节软骨的破坏和滑膜组织增厚,最终导致骨活动受限,但具体发病原因十分复杂且迄今尚不完全清楚。青藤碱(Sinomenine)是从防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤茎中提取得到的一种生物碱,在中国用来治疗RA,临床总有效率可达85%,也被用于甲氨蝶呤(MTX)辅助治疗RA。尽管青藤碱在治疗炎症疾病方面取得了不错的成绩,但是迄今其具体的作用机理和靶点蛋白和基因并不很清楚,且青藤碱具有效果较弱、剂量大以及其它一些副作用,目前对于青藤碱的结构改造以期得到活性更好的药物分子方面没有令人满意的进展,为此我们合成了一系列青藤碱衍生物的Dimers,首先利用MTT法对其进行药物毒性评价,然后评估其抑制NO过量生成和iNOS mRNA表达的活性；同时提出了青藤碱类Bivalent Ligands的概念,合成了一系列相关化合物并利用体外抗炎模型进行抗炎活性评估,进而对体外活性好的化合物进行作用机理考察,最后对体外活性好的化合物进一步进行体内实验评估,旨在发现新的抗炎活性分子和研究其抗炎作用机制,两个化合物(3-11和3-14)显示了较好的体内活性。一.青藤碱及其衍生物Dimer的合成及其抗炎活性研究合成了一系列青藤碱衍生物通过1位碳碳相连的二聚体(Dimer),其中单体包括C环完全被还原的化合物、青藤碱体内重要的代谢物17去甲基青藤碱、C环将羰基改造为氨基之后引入重要的抗炎和抗肿瘤基团磺酰胺基的化合物,和C环并有氮杂环喹喔啉结构的化合物。平面结构相同的Dimer具有(S)-和(R).两种不同构型,其立体结构可通过比较二者1HNMR中C-2的化学位移及CD中特征区域内科顿效应来方便地加以区别和确定。采用LPS诱导巨噬细胞产生NO模型对上述单体以及Dimers进行抗炎活性评价,结果表明：青藤碱C环被还原后活性明显增加,6.脱氧-7-脱甲氧基-7,8--二氢青藤碱(2)和其Dimers活性均很好且其(S)-构型的二聚体2-3更好于(R)-构型的二聚体2-4。青藤碱及其衍生物的C1.C1’-二聚物中,空间阻力小的二聚体(S-型)整体上活性较好,而空间阻力大的二聚体(R-型)对活性提高影响不大,甚至有的(R)-二聚体还对NO的生成具有促进作用。RT-PCR实验表明化合物2-1,2,2-3,2-4和4能显著抑制iNOS的mRNA表达,并呈现出明显的量效关系,而前体化合物青藤碱仅在100μM时有微弱抑制。说明青藤碱衍生物可能在包含iNOS的信号通道中有重要的作用。(R,S)-二聚体仅仅是因为C1-C1’夹角不同,但是却呈现出了不同的活性,这值得深入研究,相关机理阐释和多样性底物合成工作课题正在研究中。二.青藤碱类Bivalent Ligands的合成及其抗炎活性研究以青藤碱4位羟基为链接位置,合成了一系列青藤碱bivalent ligands分子,linker的选择范围包括脂肪族酯类和醚类、芳香族醚类以及多乙二醇醚类。为了在活性研究中深入探讨青藤碱bivalent ligands分子的SAR,合成了这些化合物相对应的monovalent ligands化合物,同时扩展合成了青藤碱衍生物的bivalent ligands分子,主要包括青藤碱C环改造产物6β对甲苯磺酰胺基-7β-甲氧基-7,8-二氢青藤碱、6,7-喹喔啉青藤碱、6-脱氧-7-脱甲氧基-7,8-二氢青藤碱和6β-氨基-7β-甲氧基-7,8-二氢青藤碱的bivalent ligands化合物。首先采用LPS诱导巨噬细胞产生NO模型对青藤碱bivalent ligands和monovalent ligands化合物进行抗炎活性评价,结果显示：对于酯类bivalent ligands和monovalent ligands,链长较短(bivalent ligands碳4到6,monovalent ligands碳4和5)时对活性及毒性都影响甚微；链长中等(bivalent ligands碳7和8,monovalent ligands碳6和7)时化合物的毒性明显,未作进一步研究；链长较长的酯类化合物(3-4、3-10和3-11)能非常明显的抑制NO生成且无明显的细胞毒性。说明酯类bivalent ligands和monovalent ligands的链长长度对生物活性确有影响且呈现出一定规律性,链长较长的化合物对抑制NO过量生成的效果明显。醚类bivalent ligands和monovalent ligands表现出了与酯类化合物相反的规律。链长中等的醚类化合物3-14、3-15和3-27能明显的抑制NO生成且无明显的细胞毒性,尤其是3.14抑制NO的IC50为15.2μM；链长较长时(bivalent ligands碳6和7,monovalent ligands碳6、9和10)毒性IC50则超过了活性IC50；Linker为二苄基的醚类bivalent ligands毒性也很明显；聚乙二醇醚类(三乙二醇醚和四乙二醇醚)bivalent ligands对活性及毒性均影响甚微。对NO抑制活性好的化合物进行抗炎细胞因子评价,3-14能明显抑制TNF-α的生成,3-10、3.11和3-27能明显抑制IL-6的生成,说明不同类化合物可能通过不同的机制起作用。Western blot结果表明3-11能同时抑制NF-κB和MAPK信号通道中的IκBa、NF-κB、 SAPK/JNK, ERK1/2及p38等蛋白的磷酸化,还能明显的抑制细胞核内NF-κB与DNA的结合,说明化合物3-11可以多通道的抑制炎症细胞因子的生成和释放,为3-11能在体外很好抑制NO和IL-6生成的活性提供了有力的证据。3-14可以明显地抑制NF-κB信号通道中NF-κB的活化,不抑制IκBα的活化但抑制其泛素化降解,而对细胞核内NF-κB-DNA的结合无明显抑制,说明3-14能够特异性抑制NF-κB的磷酸化和IκBα的降解。采用感染性休克模型评价3.11和3-14治疗急性炎症的效果,发现能大大提高小鼠存活率。26小时后,3-11组存活率为30%,而3-14组存活率仍然高达70%。化合物3-14表现出了特别好的治疗急性炎症的效果。3-11和3-14组明显抑制了血清中TNF-α和IL-6的两者生成,这也是个非常有趣的现象,因为在体外RAW264.7细胞培养中3.14只抑制’[NF-α的生成而3.11只抑制IL-6的生成,但体内实验中两个化合物都明显抑制TNF-α和IL-6的生成。3-14体内体外抑制TNF-α生成的活性均比3.11的活性强,这或许是3-14组有更好对抗脓毒能力和更高存活率的原因之一。有关3-11和3-14抗炎机理包括靶点蛋白的确定和其它青藤碱衍生物bivalent ligands的生物活性测试以及底物扩展合成正在进行中。