高脂血症（Hyperlipidemia）指血液中血脂水平异常升高,是目前常见的代谢疾病。高脂血症患者大多伴有“中心性肥胖”,且异位脂肪堆积严重。这种疾病通常无明显症状,常常被人忽略。随着生活水平的提高,高脂血症的发病率越来越高,且日趋低龄化。高脂血症疾病往往与肥胖、2型糖尿病、心脏病、痴呆、心肌梗塞、中风睡眠呼吸暂停和动脉粥样硬化等高死亡率的疾病相关,是目前人类迫切需要解决的健康问题。与含有大脂滴、线粒体少的白色脂肪细胞相比,棕色脂肪细胞中脂滴小,线粒体含量高,并存在解偶联蛋白1（UCP1）。UCP1为棕色脂肪（BAT）提供了从储存的脂肪酸中产生热量的能力。在过去的十年里,BAT已经成为一个热门的研究领域,其活性与体重指数和体脂质量呈负相关,对能量消耗和脂蛋白代谢起着重要作用。对小鼠的研究表明,BAT激活导致细胞内甘油三酯分解,产生氧化、解偶联呼吸和产热,减少白色脂肪（WAT）的堆积。目前研究发现,WAT可以在寒冷或药物的刺激下,出现棕色脂肪样作用,功能从储存能量变为消耗能量,即白色脂肪棕色化。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）在能量平衡调节中起主要作用。AMPK被激活后可增加能量消耗。AMPK信号通路是一条调节能量稳态的经典途径,它通过将激素和代谢物等外周信号与神经元网络结合起来来调节能量平衡。目前研究证实,AMPK通过调节交感神经系统和葡萄糖稳态,在下丘脑和后脑中参与摄食、棕色脂肪组织的产热和白色脂肪组织的棕色化。AMPK参与白色脂肪细胞的棕色化的机制尚不清楚。黄芪散方中黄芪、葛根、桑白皮按1:2:1组成,本课题组前期研究表明黄芪散具有降脂、减肥,并有良好的调节脂代谢紊乱作用,但其降脂平衡全身能量的作用机制尚未阐明。本研究工作如下:目的:本实验建立饮食诱导的高脂血症大鼠,研究黄芪散给药后对棕色脂肪和白色脂肪（皮下脂肪、附睾脂肪）中产热耗能相关基因和蛋白表达的影响;以及对肝脏和骨骼肌中脂肪酸氧化的关键途径即AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）/乙酰辅酶A羧化酶（ACC）/肉碱脂酰转移酶Ⅰ（CPT1）信号通路及合成胆固醇的关键靶点即固醇调节元件结合蛋白（SREBP2）、HMG-Co A还原酶（HMGCR）的影响,从而探讨黄芪散改善高脂血症的作用机制,为黄芪散的临床用药提供依据。此外,初探“棕色化”和“AMPK”之间的联系,为后续研究白色棕色化作用机制提供思路。方法:1.黄芪散对高脂血症大鼠的治疗作用本实验建立纯高脂饲料饮食诱导的高脂血症大鼠,将50只雄性SD大鼠,适应性饲养1周后,随机分成5个组,每组10只,分别为正常组（SD）、高脂饲料模型组（HFD）、黄芪散低剂量组(HQS-L;1g·kg-1)、黄芪散高剂量组(HQS-H;2g·kg-1)、阳性立普妥组(Lipitor;2 mg·kg-1)。在整个饲养过程中,正常组饲喂正常饲料,其他组饲喂高脂饲料。造模9周后,给药13周后观察研究黄芪散给药后对高脂血症大鼠的体重变化、lee’s指数、糖脂代谢水平、葡萄糖耐受量、肝脏和骨骼肌损伤程度、肝脂肪变性、棕色脂肪、附睾脂肪及皮下脂肪的病理形态等的影响,从而探讨黄芪散对高脂血症大鼠的治疗作用。2.黄芪散对高脂血症大鼠棕色脂肪及白色脂肪棕色化的影响研究黄芪散给药后,观察棕色脂肪超微病理中产热场所线粒体和脂滴的变化;采用Q-PCR法测定黄芪散对棕色脂肪、皮下脂肪及白色脂肪中棕色脂肪标志基因UCP1、Prdm16、CD137、TBX1,产热基因PGC1α、PGC1β,脂肪酸氧化相关基因CPT1a、PPARα,线粒体合成基因Tfam、NRF1、NRF2 m RNA的影响;采用免疫组化测定棕色脂肪和皮下脂肪中UCP1的蛋白表达;采用蛋白免疫印迹（WB）法测定黄芪散对棕色脂肪、皮下脂肪及白色脂肪中棕色标志蛋白UCP1、Prdm16,线粒体合成蛋白ATP5A,从而探讨黄芪散通过激活棕色脂肪及白色脂肪棕色化改善高脂血症的作用机制。3.黄芪散对3T3-L1脂肪细胞棕色化作用的影响在体外实验,以3T3-L1前脂肪细胞为研究对象,采用CCK法测定黄芪散对3T3-L1脂肪细胞的增殖活性,确定后期实验黄芪散给药浓度;采用经典方法诱导分化3T3-L1脂肪细胞为成熟脂肪细胞（白色脂肪细胞）;后续黄芪散分别在诱导后给药48h和诱导过程全程给药实验;采用Q-PCR法测定黄芪散对成熟脂肪细胞中棕色脂肪标志基因UCP1,米色脂肪标志基因CD137、TBX1,产热基因PGC1α、PGC1β,脂肪酸氧化相关基因CPT1a、PPARα,线粒体合成基因Tfam、NRF1、NRF2 m RNA的影响;采用蛋白免疫印迹（WB）法测定成熟脂肪细胞中UCP1的蛋白表达,从而探讨黄芪散白色脂肪棕色化的作用靶点,以及黄芪散改善脂质代谢的分子机制。4.黄芪散对高脂血症大鼠AMP蛋白激酶信号通路的影响研究黄芪散给药后,对脂肪酸氧化的关键途径即AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）/乙酰辅酶A羧化酶（ACC）/肉碱脂酰转移酶Ⅰ（CPT1）信号通路及合成胆固醇的关键靶点即固醇调节元件结合蛋白（SREBP2）、HMG-Co A还原酶（HMGCR）m RNA和蛋白的影响,探讨黄芪散降脂的作用机制。结果:1.与正常组相比,高脂饮食诱导的高脂血症大鼠可显著增加体重、腹围、Lee’s指数和血清中FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST的水平,而血清中HDL-C的水平和口服糖耐量则明显降低,成功地建立了高脂血症大鼠模型。黄芪散显著降低了高脂血症大鼠的体重、腹围及Lee’s指数,同时也降低了肝脏、附睾脂肪、肾周脂肪的脏器系数;也显著降低了高脂血症大鼠血清中FPG、TC、TG、LDL-C水平,改善口服糖耐量;同时,黄芪散显著降低血清中AST、ALT水平;此外,黄芪散还可以改善肝脏、骨骼肌、棕色脂肪、皮下脂肪及附睾脂肪的病理形态,油红O染色显示黄芪散减少了肝细胞中脂滴。结果表明,黄芪散具有改善高脂血症、保护肝脏的作用。2.在体内实验,黄芪散给药后明显的增加了线粒体的数目;黄芪散均呈剂量依赖的增加了脂肪组织的棕色标志基因UCP1、Prdm16,产热基因PGC1α、PGC1βm RNA的表达;也显著增加了脂肪组织中基因CPT1a、PPARα、CD137、TBX1 m RNA的表达;同时,黄芪散显著增加了脂肪组织中基因Tfam、NRF1、NRF2 m RNA的表达;此外,黄芪散明显的增加了蛋白UCP1、Prdm16、ATP5A的表达。结果表明,黄芪散通过增加线粒体数目及活性从而激活棕色脂肪,并促进白色脂肪棕色化（尤其是皮下脂肪）,增加产热耗能来改善脂质代谢,治疗高脂血症。3.在体外实验,黄芪散对3T3-L1的最低有效浓度为80μg/ml,黄芪散给药剂量为160μg/ml的浓度下,不仅可以显著地降低成熟脂肪细胞中的脂质积累,还可以明显增强棕色脂肪的标志UCP1的基因和蛋白表达,增强脂肪细胞的棕色样作用。此外,黄芪散也显著增加了棕色脂肪产热基因PGC1α、PGC1β和米色脂肪的标志基因CD137的表达。黄芪散增加了脂肪酸氧化相关基因CPT1a、PPARα和线粒体生物合成关键酶基因NRF1、NRF2、Tfam的表达。结果表明,黄芪散可以通过增加UCP1的表达使3T3-L1脂肪细胞棕色化,并增加线粒体合成来促进棕色样活性,同时也增强了脂肪酸氧化耗能。4.在体内实验,黄芪散给药后增加高脂血症基因PRKAA1、PRKAA2、ACACA、ACACB、CPT1A m RNA的表达;降低了SREBF2和HMGCR m RNA的表达;显著增加了p-AMPK、p-ACC和CPT1A的蛋白表达;对AMPK、ACC蛋白表达基本无影响;黄芪散明显降低了HMGCR和SREBP2的蛋白表达。结果表明,黄芪散能磷酸化AMPK,增加脂肪酸氧化,抑制胆固醇合成,改善高脂饮食诱导的高脂血症。结论:1.黄芪散显著降低高脂血症大鼠的体重、血糖、血脂、肝酶活性及内脏脂肪,改善各脏器的病理形态,具有改善高脂血症、保护肝脏的作用。2.黄芪散显著的增加了高脂血症大鼠脂肪组织UCP1基因和蛋白的表达,通过增加线粒体数目及活性从而激活棕色脂肪,并促进白色脂肪棕色化（尤其是皮下脂肪）,增加产热耗能来改善脂质代谢,治疗高脂血症。3.黄芪散可以通过增加UCP1的表达使3T3-L1脂肪细胞棕色化,并增加线粒体合成来促进棕色样活性,同时也增强了脂肪酸氧化耗能。4.黄芪散通过激活高脂血症大鼠AMPK,调节ACC/CPT1通路来增加脂肪酸氧化,减少脂肪的堆积;抑制SREBP2及HMGCR的表达,抑制胆固醇的合成,改善高脂饮食诱导的高脂血症。