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目的:研究衰老状态下学习记忆功能减退在脑不同层次阴阳失衡的表现和发生机制,初步阐明地黄饮子对衰老模型小鼠海马突触可塑性的作用机制,为补肾健脑法提供现代生物学依据。方法:采用理论探讨与实验研究相结合的方法。1、理论探讨:系统梳理中医学和现代医学对衰老及学习认知的认识,探讨从肾论治衰老学习记忆功能减退的可能性。2、实验研究:(1)实验分组:设正常对照组、衰老模型组、地黄饮子(低、中、高剂量)组和盐酸美金刚阳性药物组共计6组。其中,以6月龄雄性SAMP8小鼠作为衰老动物模型,以同月龄雄性SAMR1小鼠为正常对照,其他各组采用同月龄雄性SAMP8小鼠并给予药物干预。(2)给药干预:各组动物正常饮食条件喂养至5月龄后,从第6个月开始地黄饮子(低、中、高剂量)组小鼠分别每天灌胃不同浓度的地黄饮子水煎液(7.51g/kg·d、15.02g/kg·d、30.04g/kg·d),盐酸美金刚组小鼠灌胃盐酸美金刚混悬液(3.03mg/kg·d),正常对照组和衰老模型组动物小鼠灌胃等量溶媒。各组动物每天灌胃给药1次,连续1个月后,进行如下指标检测。(3)学习记忆能力评价:采用Morris水迷宫和新物体识别实验方法评价各组小鼠的空间学习能力、空间参考记忆力和新物体识别能力。(4)突触结构可塑性检测:采用透射电镜技术观察各组小鼠神经元和突触结构的形态变化。(5)突触功能可塑性检测:对各组小鼠海马内“schaffer侧枝-CA1区”突触回路进行在体场电位记录实验,观察LTP和LTD现象,评价突触传递效率。(6)海马神经递质检测:采用酶联免疫吸附实验方法检测各组小鼠海马组织谷氨酸和γ-氨基丁酸含量的差异。(7)谷氨酸受体和钙调素依赖性蛋白激酶II的检测:采用蛋白免疫印迹法检测各组小鼠海马组织AMPAR2、NMDAR1、pNMDAR1、NMDA2A、pNMDA2A、NMDA2B、pNMDA2B、CaMKII、pCaMKII共9个蛋白的含量和磷酸化水平。结果:1.理论研究结果:基于“肾脑相关”理论,从经络联系、精髓关系、元神、肾志与脑神的关系,以及阴阳变化5个方面探讨了从肾论治衰老学习记忆功能减退的可能性;并且基于阴阳学说理论,认为现代脑科学相关研究成果都是阴阳之象,是对中医阴阳理论的丰富和扩展,用阴阳的思维模式去认识脑具有可行性。2.实验研究结果:(1)行为学检测结果:Morris水迷宫检测结果显示,与正常对照组相比较,衰老模型组小鼠空间学习记忆能力显著下降(P<0.05);与衰老模型组相比,地黄饮子高剂量可以有效提升小鼠空间辨识和记忆提取能力,减少空间搜索时间(P<0.05);新物体识别显示,与正常对照组相比较,衰老模型组小鼠记忆力受损(P<0.05);与衰老模型组相比,地黄饮子高、中剂量均能使小鼠准确区分被更换的物体(P<0.05),并增加其对新物体辨识的时间(P<0.01)。(2)在体场电位记录结果:快速老化的SAMP8小鼠的兴奋性突触后电位经过200Hz的高频刺激后增幅不明显,LTP效应明显低于相同月龄的抗老化SAMR1小鼠(P<0.001),给予地黄饮子治疗后,则可以有效增强模型小鼠的LTP效应(P<0.05)。而在2Hz的低频刺激下,各组小鼠LTD的易化效应和EPSP的抑制程度具有明显的差异。与6月龄的快速老化SAMP8小鼠相比,相同月龄的抗老化SAMR1小鼠LTD效应仅在低频刺激后的小段时间内受到强化,随着时间流逝,其LTD易化现象逐渐恢复,突触后的兴奋性电位逐渐恢复正常(P<0.001);给予地黄饮子治疗后,地黄饮子高剂量组小鼠的LTD效应也得到一定程度的恢复(P<0.05)。(3)透射电镜检测结果:通过透射电镜我们可以观察到,模型组小鼠的海马CA1区神经元细胞损伤、突触间隙增大或消失,突触前、后膜不清晰,突触小泡减少,突触后致密物质变薄;线粒体结构崩解,嵴断裂或溶解。给予地黄饮子灌胃治疗后,神经元细胞器损伤减少,突触结构得到修复。(4)ELISA检测结果:衰老模型组小鼠海马内Glu与GABA含量显著增加(P<0.001),经过药物治疗后,各组小鼠海马内Glu与GABA含量均有所降低,尤其是地黄饮子高剂量组的Glu与GABA含量降低最明显(P<0.01)。(5)WB检测结果:SAMP8模型小鼠海马内AMPAR2、NMDAR1和NMDA2B的含量升高(P<0.05),CaMKII含量降低(P<0.05),pNMDAR1、pNMDA2A和pNMDA2B的含量增高(P<0.05),pCaMKII含量降低(P<0.05)。运用地黄饮子治疗后,中剂量地黄饮子可以有效降低NMDAR1的蛋白含量(P<0.01);高剂量地黄饮子可以有效增加CaMKII的蛋白含量和磷酸化程度(P<0.05),降低AMPAR2、NMDA2B和pNMDA2B的异常表达(P<0.05)。结论:1.海马组织Glu和GABA含量增高、代谢失衡与衰老状态小鼠学习记忆功能减退有关;2.海马“schaffer侧枝-CA1区”突触回路的LTP/LTD效应失衡是衰老状态下学习记忆功能减退的脑电生理层面阴阳失衡的机制;3.海马神经细胞内钙离子超载是衰老状态下脑电生理和氨基酸神经递质层面阴阳失衡的关键因素。4.补肾方剂地黄饮子可通过调节神经细胞内钙离子浓度,抑制钙内流而易化神经突触可塑性,从而改善衰老小鼠的学习记忆功能。