论文部分内容阅读
目的：应用高效、低毒的天然活性药物南瓜蛋白(Cucurmosin,CUS)对骨髓瘤RPMI8226细胞体外增殖作用实验、凋亡检测及Notch相关信号通路的研究，初步探讨CUS对RPMI8226增殖、凋亡等机制，为CUS治疗MM提供理论依据。方法：采用MTT法检测CUS对体外培养的RPMI8226细胞增殖抑制作用（量效和实效）；胎盘蓝拒染法计数活细胞绘制生长曲线，测定CUS对RPMI8226细胞增殖能力的影响；集落增殖抑制试验测定CUS对PRMI8226细胞的体外增殖抑制作用；透射电镜观察CUS作用后的细胞超微结构；Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；PI单染流式细胞术DNA倍体分析；Western blot检测CUS作用PRMI8226细胞后凋亡相关蛋白bcl-2和casepase-3、casepase-8、casepase-9等表达水平的变化及Notch信号通路相关信号Notch1、Jagged-2、P-Akt和Nf-kB表达水平的变化。结果：1. MTT比色法结果显示：不同剂量CUS（0、0.0078、0.0156、0.0625、0.125、2.0umol/L）作用RPMI8226细胞不同时间（24h、48h、72h）后增殖抑制率从7.0%提高到86.4%，其24h、48h、72h的IC50分别为80umol/L，0.65umol/L，0.2umol/L。呈时间和剂量依赖性。各时段CUS干预组与阴性组比较有显著性差异（P<0.01）。2.生长曲线结果表明：CUS药物处理组的细胞生长状态明显不如对照组，随着药物浓度的增加，细胞数明显减少，其生长缓慢的潜伏期延长，对数期曲线的斜率趋于平缓。不同剂量CUS干预组与阴性组比较有显著性差异（P<0.05）。3.集落增殖抑制试验表明：不同剂量CUS(0.0078、0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25umol/L)作用RPMI8226细胞7天后集落形成率由50.5%减少到5%，集落抑制率由18.5%提高到91.9%。不同剂量CUS干预组与阴性组比较有显著性差异（P<0.05）。4.透射电镜观察到：与对照组相比，实验组细胞体积变小、皱缩，细胞核明显减小且不规则，核质比减小，核呈现分叶、破碎及边集等凋亡现象，核内异染色质增多，染色质固缩、浓集，出现典型的凋亡改变，并有凋亡小体(Apoptosis body)形成。5. Annexin V/PI双染流式细胞术检测凋亡率呈量效关系逐渐增加，不同浓度CUS（0、0.125、0.5和2umol/L）各组的凋亡率分别为：7.44、12.49、17.48和26.41％。PI单染流式细胞仪结果显示也同样呈明显的浓度依赖性，DNA倍体分析呈现典型的亚G1(sub-G1)凋亡峰，不同浓度CUS（0、0.0078、0.0312、0.125、0.25umol/L）作用72h后的凋亡率分别为0、4.2、10.8、30.6和42.2％，呈剂量依赖性。不同剂量CUS干预组与阴性组比较有显著性差异（P<0.05）。6. Western blot结果显示：CUS作用RPMI8226细胞72h后，bcl-2表达水平明显下调，而caspase-3和caspase-8、caspase-9则表达显著上调，呈明显的时间和浓度依赖性。同时有关Notch信号通路Notch1、Jagged-2、P-Akt和Nf-kB也以时间和浓度依赖的方式表达下调。结论：1.CUS对体外培养的RPMI8226细胞具有明显的增殖抑制作用，并呈时间-剂量依性。2.CUS能有效诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡，并在一定浓度范围内呈时效和量效关系。3.CUS明显下调RPMI8226细胞Notch信号通路Notch1、Jagged-2、P-Akt和Nf-kB的表达水平，可能也是CUS抗白血病的作用机制之一。