论文部分内容阅读
目的：利用小鼠单核细胞RAW264.7细胞株培养系，研究大黄酸对体外诱导培养的破骨细胞形成及分化的影响，同时探讨大黄酸是否通过凋亡途径抑制破骨细胞的形成及分化，为进一步研究大黄酸及破骨细胞提供依据。方法：选用小鼠单核细胞RAW264.7系细胞株，进行体外破骨细胞诱导培养，观察大黄酸对破骨细胞形成、分化的影响，同时通过流式细胞术分析大黄酸对破骨细胞凋亡作用。1细胞培养及药物添加：1.1细胞复苏和培养：取冻存小鼠单核细胞RAW264.7系细胞株1管，在37℃恒温水浴箱中快速复苏，然后移至含有10%胎牛血清的α-MEM培养液的离心管中离心5分钟（1000转/分），弃去上清液，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，移至培养瓶中，放置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞密度达到90%后，用胰酶+EDTA将细胞重悬，收集细胞。将所收集的细胞置于离心机内离心5分钟（1000转/分），弃去上清液，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，用细胞计数板计算细胞数，计算出细胞原液浓度，然后配制浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液，加入RANKL50ng/ml、M-CSF20ng/ml、青霉素100单位/ml和链霉素100ug/ml。将细胞播种于96孔培养板（4行6列）中，每孔加入浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液150μL。将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养5天。1.2药物的添加：细胞播种后，在96孔培养板第一列为对照组，不添加任何药物。第二至五列加入大黄酸，浓度分别为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L。2抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色：细胞培养至第5天后行TRAP染色，倒置光镜下观察，计算TRAP染色阳性细胞数。3流式细胞术检测细胞凋亡：3.1细胞培养：用传代细胞继续培养，待瓶底细胞密度达到90%后，用0.25%胰酶+EDTA将细胞重悬，收集细胞。将所收集的细胞移至离心管内离心5分钟（1000转/分），弃去上清液，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，用细胞计数板计算细胞数，计算出细胞原液浓度，然后配制浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液，加入RANKL50ng/ml、M-CSF20ng/ml、青霉素100单位/ml和链霉素100ug/ml。将细胞播种于24孔板的两孔中，每孔加入浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液500μL。3.2药物的添加：在24孔培养板第一孔为对照组，不添加任何药物。第二孔选取对破骨细胞形成抑制最明显的大黄酸浓度为添加药物组（10-3mol/L）。3.3流式细胞术检测细胞凋亡：细胞培养至第5天后，用0.25%胰酶+EDTA将细胞重悬，分别收集对照组与药物添加组细胞，置于离心机内离心5分钟（1000转/分），弃去上清液。用4℃PBS缓冲液将细胞重悬，置于离心机内再离心5分钟（1000转/分），弃去上清液。以300μL1x缓冲液将细胞重悬，每管加入Annexin V5ul、Pi10ul，静置30分钟，再加入200μL1x缓冲液，立刻将细胞置于流式细胞仪检测细胞凋亡。重复流式细胞术检测细胞凋亡3次。4统计学分析：使用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据处理采用非参数检验的方差分析和S-N-K检验，流式细胞结果采用t检验。结果：1破骨细胞的形态学特征细胞培养第一天各组均未见破骨细胞形成；自培养第二天开始对照组可见少量破骨细胞形成，实验组无变化；培养至第三天实验组可见少量破骨细胞形成；培养至第五天，各组均可见到成熟破骨细胞。进行TRAP染色后，光镜下可见到大量成熟的破骨细胞，其形态学特征为：细胞体积较大，呈漏斗形、椭圆形、油煎蛋样、条索状或不规则形。细胞浆丰富，呈紫红色，细胞核较大，数目达几个甚至多达十几个，核仁清晰，有的细胞浆内可见空泡结构。2大黄酸对破骨细胞的形成和分化具有抑制作用，高浓度比低浓度在相同条件下形成的破骨细胞数目少。在小鼠单核细胞RAW264.7系细胞株培养系中，培养板第一列（对照组）没有添加药物，最终破骨细胞形成最多；第二列加入浓度为10-3mol/L大黄酸，形成的破骨细胞最少；第三、四、五、六列加入大黄酸的浓度分别为10-4、10-5、10-6、10-7mol/L，最终都有破骨细胞的形成，并且形成破骨细胞的数目较第二列多，并且呈梯度递增，与第一、二列相比统计学有显著性差异（P<0.05），说明大黄酸对破骨细胞的形成和分化具有抑制作用。3大黄酸是通过细胞凋亡途径影响破骨细胞的形成和分化的。流式细胞散点图显示与对照组比较，实验组散点在Q2、Q4象限分布增多，并且对照组和实验组之间有统计学意义，证明大黄酸是通过细胞凋亡途径影响破骨细胞的形成和分化的，并且主要是影响细胞的中晚期凋亡。结论：1.大黄酸可以抑制破骨细胞的形成和分化。2.大黄酸通过细胞凋亡途径影响破骨细胞的形成和分化。3.大黄酸主要影响细胞的中晚期凋亡。