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背景:大量研究发现HBV基因型/亚型与病毒感染途径、基因突变、疾病进程和抗病毒疗效具有一定相关性,且不同地域和人群的基因亚型分布有显著差异。但在以往的研究中,HBV基因型和基因亚型分型的方法多采用PCR RFLP法,其检测结果受到限制性内切酶的功能状态、酶的反应条件及操作人员技术水平等影响较大,这些因素制约了PCR RFLP的检验效能。传统的PCR产物直接测序法获得的信息直观丰富,是基因亚型分型的金标准,但其敏感性较低,通常只有104 IU/ml水平,无论应用于临床检测还是科学研究都很难达到理想的效果。此外,我们在分析大样本量的序列数据时,发现采用人工判断和统计序列差异的方法工作量大、效率低,而国外已有的HBV序列分析数据库都以欧美流行的A型、D型、E型HBV序列为主,且很多数据库需要付费才能使用。目的:本研究拟建立高度敏感特异的HBV序列扩增方法,检测HBV RT全基因和前C区所有突变;建立HBV序列数据库,借助数据库的数据分析和汇总功能,分析2377例HBV序列的RT区耐药突变情况、前C/BCP突变情况、CTL表位变异情况,并对基因亚型B2和C2在乙肝相关疾病进展各个阶段的比例进行分析,从不同角度阐明HBV基因亚型与疾病转归的关系。内容:选取2007年7月至2008年12月于解放军302医院就诊的华北地区(北京、河北、山西、天津、内蒙古五省)2377例慢性HBV感染患者(男性1981例,女性396例;年龄38±13岁),其中慢性乙肝(CHB)患者1874例,乙肝相关肝硬化(LC) 354例,慢加急性肝衰竭(ACLF) 32例,肝细胞癌(HCC) 117例。诊断标准均参照2000年9月(西安)全国会议修订的《病毒性肝炎防治方案》标准,排除乙丙重叠感染及HIV混合感染者。方法:提取慢性HBV感染患者血清HBV DNA,采用巢式PCR扩增前S/S基因和前C/BCP区基因,对PCR产物直接测序。根据测得前S/S基因序列构建系统进化树确定基因型/亚型。建立包含耐药突变分析、前C/BCP基因突变分析、CTL变异分析等多种生物信息学功能的HBV序列数据库,分析基因亚型B2和C2间,RT区耐药突变rtL80I、rtV84M、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtT184A/I/L/P/S、rtS202G、rtM204I/V、rtN236T、rtM250L的发生率差异;分析前C/BCP区T1753A/C/G、T1758C、A1762T、G1764A、C1766T、T1768A、G1862T、G1896A、G1899A的突变发生率差异;分析多聚酶区和表面抗原区CTL特异性表位变异频率和变异类型差异;分析基因亚型B2和C2病毒在不同进程病情患者中的分布频率。结果:1.建立了高效敏感的HBV序列扩增方法:通过对实验条件的不断优化,我们建立了高效、敏感的preS/S (包含RT全基因序列)区扩增方法,可同时检测HBV RT全基因和前C区所有突变;对RT耐药突变的检测敏感性达到了100 IU/ml,较国际公认测序法的敏感性(≥104 IU/ml)提高了2个数量级;克服了高病毒载量耐受的难题,可同时检测病毒载量相差1亿倍的样本。2.建立了大样本患者的HBV序列数据库:包含6800余例来自全国各地HBV感染患者的临床相关资料,11000余条HBV功能序列信息,并具有相似性检索、基因型分析、耐药位点分析、前C/BCP区分析、CTL表位分析等多种生物信息学分析功能。3.阐明HBV基因型/亚型在华北地区的分布情况:对2377例患者进行基因型/亚型分型,检出的HBV基因型有B、C、D三种,分别占83.8%(1992/2377)、15.5%(368/2377)和0.7%(17/2377)。基因亚型的例数与在所有患者中的比率为B1 10例(0.4%),B2 344例(14.5%),B3 6例(0.3%),B4 8例(0.3%),C1 28例(1.2%),C2例1937 (81.4%),C3例21 (0.9%),C4 6例(0.3%)。B基因型中以B2占绝大多数(344/368,93.5%); C型中以C2占绝大多数(1937/1992,97.2%);未发现其它基因型。华北地区各省市之间HBV基因型/亚型分布特点类似。4.阐明HBV基因型/亚型与疾病转归的关系:a.不同基因亚型患者的性别比例、HBV DNA载量、ALT、AST、TBIL、CHE、PTA、PTT值之间的差别无统计学意义。b.拉米夫定(LAM)相关耐药突变位点rtL80I、rtV173L、rtL180M、rtM204I、rtM204V的突变发生率均为C2高于B2,除M204V位点外,其余位点突变率的差异均有统计学意义(P<0.05);阿德福韦耐药和恩替卡韦耐药突变发生率并无明显差别(P>0.05)。c.基本核心启动子(BCP)区突变位点T1753A/C/G、T1758C、A1762T/G1764A、C1766T、T1768A的突变发生率均为C2亚型高于B2亚型,除T1768A外差异都有统计学意义(P<0.05);前C区突变位点G1896A则为C2亚型低于B2亚型,差异有统计学意义(P<0.05)。d. S区有5个CTL表位在基因亚型B2和C2之间的变异发生频率不同:preS2 44-53、S 14-22、S20-28、S88-96、S172-180,且其差异都有显著的统计学意义(P<0.05);P区Pol 455-463表位在基因亚型B2和C2间的变异发生频率不同,其差异有显著的统计学意义(P<0.05)。B2和C2亚型间各个CTL表位的变异类型也有很大区别,如B2亚型病毒S 38-47表位的变异类型主要为SLNFLGGTPV,而C2亚型则主要为SLNFLGGAPT;B2亚型S207-216表位的变异类型主要为NILSPFMPLL,C2亚型则为NILSPFLPLL。e.随着患者病情以AHB→CHB→LC→ACLF→HCC的顺序逐步发展,C2亚型在各组患者间的比例逐渐增大,在AHB患者中C2:B2患者例数比例为1.7,CHB患者中为5.7,LC患者中为7.5,ACLF患者中为8.0,HCC患者中为15.3。结论:建立了以我国HBV患者流行的B型和C型为主、包含完整患者资料、大量序列信息和多种生物学功能的序列数据库。我国华北地区流行的HBV病毒以C型和B型为主,D型也有少量分布;其中C2和B2为主要亚型,占患者总数的95.9%。B2和C2两种基因亚型病毒感染患者间的耐药突变发生率有一定差异,LAM相关耐药位点的突变发生率为C2亚型高于B2亚型,而ADV和ETV耐药相关位点的突变发生率无明显差异;BCP区突变率为C2亚型高于B2亚型,但前C区的G1896A位点为B2亚型高于C2亚型;各CTL表位B2和C2亚型变异发生频率和变异形式都有很大差异。总体来讲,C2型HBV感染转B2型HBV感染更易向慢性化发展,并更易引起慢性肝炎的重症化。