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ECF(Energy-coupling factor)转运蛋白属于一类新型ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白,主要存在于原核生物中,负责多种维生素和微量元素的跨膜运输。ECF转运蛋白由细胞膜上特异性结合底物的EcfS蛋白和负责能量偶联的EcfT蛋白及胞内结合与分解ATP的EcfA/A蛋白组成,其中EcfT和EcfA/A被称为能量耦合模块或ECF模块。ECF转运蛋白家族可以分为两类:在Ⅰ类ECF转运蛋白中,不同的EcfS蛋白有专用的一套ECF模块;在Ⅱ类ECF转运蛋白中,不同的EefS蛋白能够共享同一套ECF模块。 近年来,人们在ECF转运蛋白结构与机理的研究中取得了一些进展,先后解析了四种EcfS蛋白单体和两种Ⅱ类ECF转运蛋白复合体的三维结构,初步阐明了Ⅱ类ECF转运蛋白的组成方式及亚基间的相互作用,使人们对ECF转运蛋白的跨膜转运过程有了一些了解。但是仍然有许多问题有待回答,例如:为什么在Ⅱ类ECF转运蛋白中不同的EcfS蛋白可以共享同一套ECF模块?Ⅰ类ECF转运蛋白复合体的结构是怎样的,与Ⅱ类有何异同? 为了回答上述问题,在第一部分工作中,我们首先重组表达了来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的、预测底物为泛酸的Ⅱ类ECF转运蛋白复合体一LbECF-PanT,它能够与已知结构的LbECF-FolT和LbECF-HmpT复合体共享一套ECF模块。在鉴定了其具有泛酸转运活性之后,我们利用X射线衍射技术、结合分子置换方法解析了LbECF-PanT的晶体结构。通过结构分析和功能验证,我们找到了与底物泛酸结合有关的重要氨基酸位点,阐明了在亚基间能量偶联和构象传递过程中发挥重要功能的氨基酸残基。通过将LbECF-PanT、LbECF-FolT和LbECF-HmpT的结构进行比对,揭示了:ECF模块的组成成分之一EcfT蛋白的偶联螺旋CH3(Coupling Helix3)可与三种不同的EcfS蛋白PanT、FolT和HmpT的表面凹槽结合从而发挥一个传递齿轮的作用,将EcfA/A的构象改变传递给EcfS;而EefS的跨膜螺旋1与EcfT的偶联螺旋CH2的相互作用为EcfS相对于EcfT的运动提供了一个疏水的滑行面;同一物种中不同的EcfS蛋白有相似的传递齿轮和滑行面,构成了Ⅱ类ECF转运蛋白共享一套ECF模块的分子基础。 在第二部分工作中,我们表达纯化了跨膜转运钴离子的Ⅰ类ECF转运蛋白复合体—CbiMNQO。CbiMNQO的组成亚基CbiM、CbiQ和CbiO分别对应于Ⅱ类ECF转运蛋白的EcfS、EcfT和EcfA/A,然而CbiMNQO多了一个跨膜的CbiN蛋白亚基。通过检测复合体及各个组分的ATP水解活性和跨膜转运活性,我们发现底物结合蛋白CbiM能够激活复合体的ATP水解活性,并且发现虽然CbiN蛋白对复合体的转运活性必不可少,但是其缺失不会影响复合体的ATP水解活性。利用X射线衍射技术、结合分子置换和单波长反常散射法,我们解析了CbiMQO复合体的晶体结构。结构分析发现了蛋白亚基间的相互作用位点,结合转运活性实验证明了这些位点的重要性。通过结构的比较揭示了:底物结合蛋白CbiM的L1loop在底物的结合与释放中起到门控开关的作用;ATP结合及产物释放所导致的CbiO二聚体的构象变化。通过将CbiMQO与Ⅱ类ECF-FolT的结构进行比对,我们发现CbiM的N端多出的跨膜螺旋和loop大大增加了其与CbiQ的相互作用的面积,增强了亚基间的结合力与稳定性。基于结构的分析与比较,我们推测CbiN可能在CbiM与CbiQ的构象偶联中起到重要作用,丢失CbiN会造成CbiQ不能将构象的变化正确的传递到CbiM,造成转运活性的丧失,但并不会影响ATP的水解活性。 通过以上两部分的工作,我们揭示了Ⅱ类ECF转运蛋白中能量耦合模块的共享机制和Ⅰ类ECF转运蛋白复合体的结构及其与Ⅱ类的异同,为ECF转运蛋白领域的研究提供了新的证据和思路。