大豆是世界上重要经济农作物,大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆而引起幼苗猝死和成株的根腐病是世界大豆生产上的主要病害之一,每年给世界的大豆产业带来巨额经济损失。大豆疫霉通过感受性激素、外界温度、湿度及条件的变化而进入不同的生活周期,在侵染寄主的过程中通过感知寄主而分泌大量的降解酶、坏死蛋白、蛋白酶抑制剂等效应因子以达到成功侵染寄主的目的,因此研究大豆疫霉如何感受外界的信息及信号传导机制、效应因子的分泌机制可以为防止病害的发生和扩展提供理论依据。但由于传统的、在其他生物中运用成熟的基因敲除等分子遗传操作技术不能运用在大豆疫霉中,因此对大豆疫霉的生长发育规律及致病性机理了解的相对较少。随着大豆疫霉全基因组数据、转录组数据的不断公布及完善,开发一种快捷、易操作、高通量的基因功能研究技术平台就显得尤为重要。大豆疫霉中利用双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默。dsRNA介导的转录后基因沉默在真核生物中是普遍存在并且非常保守的一种降解靶标基因的机制。本研究将体外合成的dsRNA通过PEG介导的原生质转化方法转入大豆疫霉中从而介导目的基因的瞬时沉默,该技术不仅能利用单个dsRNA介导单个基因的沉默,更能够将不同基因合成的dsRNA同时介导多个内源基因的同时沉默。在本研究中选择了两个目的基因作为研究的靶基因,分别为细胞循环调控基因PsCdc14(调控有丝分裂细胞循环的蛋白质磷酸化酶)和一个无毒基因PsAvr3a(能被大豆抗病基因Rps 3a所识别的RxLR效应因子)。将体外分别合成的PsCdc14和PsAvr3a dsRNA转入大豆疫霉原生质体后,再生的转化子到第8天能够观察到转化子内源靶基因mRNA的减少；第9天到15天都表现出显著的基因沉默现象,沉默效率在50%-95%之间；第17天,所有的沉默转化子中内源基因都恢复到正常转录水平。本研究针对PsCdc14和PsAvr3a的基因沉默均导致了良好的表现型,证明dsRNA介导的大豆疫霉基因瞬时沉默系统可以用来鉴定基因功能,其耗时短、效率高、高通量操作的特点加快大豆疫霉功能基因组研究进展。大豆疫霉G蛋白偶联受体候选编码基因的生物信息学预测及转录分析。G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCR)是真核生物中普遍存在的一类重要跨膜受体蛋白家族,通过感受外界信息后将信号传导到细胞内,从而激活细胞内的一系列信号传导途径,并最终影响生物个体的生长发育。本研究通过生物信息学方法方法从大豆疫霉、橡树疫霉和致病疫霉的全基因组数据库中挖掘出大量GPCR候选编码基因。对三种疫霉中GPCR候选基因之间进行了同源性比较,分析了基因在基因组中的结构特征。利用RNA-sequencing和qRT-PCR等技术分析了大豆疫霉中GPCR候选编码基因在生活史及侵染各个阶段的转录情况,为后续功能基因研究提供了思路，为大豆疫霉防治及新的药物靶标筛选提供了理论基础。新型G蛋白偶联受体PsPIPK4和PsPIPK10分别参与调控大豆疫霉的无性发育及有性生殖。游动孢子具有趋化性的特点,通过感受植物表面产生的物理或化学信号来后接近寄主、休止、萌发从而成功侵染寄主。大豆疫霉有性生殖产生具有厚壁的卵孢子,可以抵抗外界的不良环境从而比营养繁殖体存活的更久,同时卵孢子也是病害主要传播手段,是病害流行的初侵染源。生物信息学分析发现大豆疫霉的基因组中含有12个新型G蛋白偶联受体,GPCR-PIPK家族,其C端为GPCR所具有的典型的7次跨膜结构,而在N端具有磷脂酸肌醇激酶(PIPK)的结构域。qRT-PCR结果显示其中的一个编码基因PsPIPK4在休止孢及休止孢萌发阶段上调表达。功能分析证明PsPIPK4沉默突变体游动孢子的游动速率变慢,并且很快休止,导致游动孢子的趋化性丧失；休止孢的萌发显著降低,导致游动孢子的致病性减弱。另一个编码基因PsPIPK10在无性发育及侵染阶段都具有较高的转录量。功能分析证明PsPIPK10沉默突变体卵孢子产量急剧减少,所产的卵孢子量只有野生型菌株的1-5%。这也是在卵菌中第一次报道候选的GPCR编码基因参与调控无性发育及有性生殖。大豆疫霉SNARE蛋白家族生物信息学预测及PsYKT6的功能分析。在真核生物中,膜泡运输参与了细胞体内一系列的生理生化反应,这其中就包括调节细胞的极性生长及一些外泌蛋白的分泌。SNARE(可溶性N-乙基马来酰胺敏感因子附着蛋白膜受体)蛋白是真核生物细胞膜泡运输过程中发生膜融合最重要的调控蛋白家族,在真核生物中非常保守。在本研究中,通过生物信息学方法在大豆疫霉基因组中预测到35个编码SNARE蛋白的基因。利用转录谱RNA-sequencing测序技术对这35个基因在无性发育及侵染阶段进行了转录分析,发现大多数基因在发育和侵染的各个阶段都具有较高的转录水平,推测其可能在大豆疫霉的生长发育及侵染过程中具有重要作用。进一步利用疫霉菌稳定遗传转化技术将其中最为保守的一个SNARE基因PsYKT6沉默后的结果证实,PsYKT6在大豆疫霉的有性生殖、无性发育及致病性方面都发挥着重要调控作用。