【摘 要】
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大片段基因组文库,如BAC和Fosmid文库,对现代基因组学研究做出了巨大贡献,在物理图谱绘制、基因组测序和基因簇的克隆等方面发挥了重要作用。构建高质量的基因组文库需要精细的操作和大量时间劳动力成本投入,随着测序成本的大幅度下降,基因组文库结合高通量测序的方法被逐步开发投入使用。基于此背景,本实验室开发了一个大片段基因组文库长双末端测序的方法。为了对这一方法的实施流程进行优化并评估其可行性,本研究
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大片段基因组文库,如BAC和Fosmid文库,对现代基因组学研究做出了巨大贡献,在物理图谱绘制、基因组测序和基因簇的克隆等方面发挥了重要作用。构建高质量的基因组文库需要精细的操作和大量时间劳动力成本投入,随着测序成本的大幅度下降,基因组文库结合高通量测序的方法被逐步开发投入使用。基于此背景,本实验室开发了一个大片段基因组文库长双末端测序的方法。为了对这一方法的实施流程进行优化并评估其可行性,本研究开展了以下三个部分的工作:1.BAC/Fosmid载体pHZAUFOS2改进。我们在pHZAUFOS2载体骨架上增加了两个I-SceⅠ酶切位点,构建了pHZAUFOS3载体。该载体保留了pHZAUFOS2的所有功能元件,可在I-SceⅠ酶切后片段化。使用pHZAUFOS3构建的基因组文库有利于长双末端序列的回收,减少测序文库中载体DNA的污染。在pHZAUFOS3基础上,在保证蛋白质序列不变的前提下,我们又将9个BfaⅠ酶切位点与1个Bam HⅠ酶切位点进行了沉默,构建了pHZAUBAC4载体。使用pHZAUBAC4构建的基因组文库可用于普通双末端（BfaⅠ完全酶解）和长双末端测序（BfaⅠ部分酶解）。2.酵母BAC文库的构建。酵母作为真核模式生物,其参考基因组序列质量高可作为理想的研究材料评估本实验室新测序方法。我们使用改进的pHZAUBAC4载体构建了酿酒酵母S288C菌株基因组BAC文库,共包含7,500个克隆,平均插入片段大小为116 kb,覆盖酵母基因组72倍,未检测到嵌合体。该文库为本实验室开发的长双末端测序方法的实施提供了材料资源,较高的文库覆盖度与高产量重组BAC质粒提取促进了该方法的研发。3.酵母基因组序列模拟组装。在评估测序技术可行性的指标中,测序成本是影响新技术推广普及的重要因素。以最低成本组装得到最完整基因组序列为目的,根据本实验室开发的长双末端测序方法,我们模拟了不同测序深度的三代测序数据（用于组装contig）以及不同物理深度的Fosmid文库（用于组装scaffold）。将不同参数组合的组装结果与参考基因组比较,得到最优参数为30x三代测序深度和20x Fosmid文库物理深度。该模拟实验为后续真实数据处理提供了前瞻性研究。
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