糖尿病肾病(Diabetic Kidney Disease, DKD; Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病最常见和最严重的并发症之一。目前DKD病人在我国血液透析病人中占第二,仅次于肾小球肾炎,积极寻找安全有效的方法预防或延缓DKD的发生与发展,对于提高糖尿病患者的生存率有着重要的意义。但是由于DKD发病机制至今未完全清楚,因此临床上仍缺乏防治DKD的有效方法,即使严格控制血糖、应用血管紧张素转换酶抑制剂及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可以减少但不能预防DKD的发生；可以延缓但不能阻止DKD的进展。近年来炎症反应学说倍受关注,认为DKD是一种自然免疫和低度炎症疾病,炎症能导致DKD,并在DKD进展的整个过程中发挥重要作用。血液动力学障碍、高糖等均可导致肾脏固有细胞的损伤,损伤的细胞通过释放前炎症介质,引起白细胞滤出到损伤部位并活化；局部浸润的炎细胞及肾脏固有细胞均可产生炎症因子,参与DKD的发生发展。大量研究已证明,DKD时浸润的炎症细胞包括单核巨噬细胞、淋巴细胞。树突状细胞(Dendritic Cell, DC)是目前已知机体内功能最强的专职抗原递呈细胞,具有炎症防御及免疫调控功能。DC的免疫调节功能与其迁移过程发育成熟状态相关,在炎症状态下,未成熟DC可在粘附分子及趋化因子介导下,由血循环迁移至外周组织,捕获、处理抗原,并于成熟后产生抗原递呈效应给T细胞、B细胞,启动局部炎症免疫反应。有学者在IgA肾病、狼疮性肾炎、急性肾损害及UUO模型证实,DC参与肾小管间质炎症反应,且DC向局部组织的迁徙与P-选择素的粘附介导有关。但是DKD肾组织中是否有DC的参与,目前国内外报道未见。因此,我们建立糖尿病大鼠模型,检测DC是否参与DKD的病理损伤过程,结果发现,DC参与DKD肾脏病理损伤过程,并且只分布于肾小管间质中,与肾小管间质的病理损伤有关,且DC分布的数量与P-选择素的表达有关。随后为进一步研究DC在DKD组织浸润的可能机制,采用熊果酸处理糖尿病小鼠,EMSA检测核转录因子-kappaB (NF-κB) DNA的活性,结果发现,DC通过NF-κB—P-选择素途径聚集于肾组织,而熊果酸可以通过抑制NF-κB活性缓解这一变化。在体外研究中我们发现,高糖能够促进骨髓来源DC表型的改变,熊果酸能够直接抑制这种变化。综上,DC参与了DKD的病理损伤过程,其向肾组织迁徙是通过NF-κB—P-选择素途径实现,高糖能够促使迁徙的DC成熟；熊果酸阻断NF-κB—P-选择素途径从而抑制DC向局部组织浸润及DC活化能力,改善DKD的病理损伤程度,这可能为DKD的发病机制及治疗提供新的理论依据。第一部分树突状细胞在糖尿病鼠肾组织的分布目的探讨树突状细胞(DC)在糖尿病肾病(DKD)鼠肾组织的分布。方法将SPF级健康雄性SD大鼠42只随机分为糖尿病模型组(D组,n=21)和阿托伐他汀治疗组(T组,n=21),另设21只大鼠为健康对照组(N组)。采用链脲左菌素(STZ)按65mg/kg一次性腹腔注射诱导糖尿病模型,72h后断尾采血测空腹血糖≥16.7mmol/L认为模型成功。阿托伐他汀治疗组大鼠自成模之日起每日清晨予阿托伐他汀20mg/kg灌胃一次,正常对照组和糖尿病模型组给以等量的饮用水灌胃。分别于治疗后第4w、8w、12w,检测尿白蛋白/尿肌酐比值、血脂、血肌酐、血糖等指标；肾组织行HE、Masson染色,光镜下观察肾脏病理改变；采用免疫荧光双染及荧光图象分析法观察CD1a+CD80+DC在各组大鼠肾组织中的分布变化；免疫组化及Western blot观察肾组织中P-选择素的表达。结果(1)与健康对照组相比较,糖尿病模型组大鼠的尿白蛋白/尿肌酐比值、肾重等指标均显著升高,HE及PAS染色可见肾组织中存在病理学损害；(2)健康对照组肾组织中未见CD1a+CD80+DC表达,糖尿病模型组肾小管、肾间质、肾血管中可见CD1a+CD80+DC表达,以肾间质表达最为显著；与4w、8w相比,12w的糖尿病模型组肾小管间质中DC表达的数量及密度明显增强；且与肾小管间质病变程度明显相关。(3)健康对照组肾组织中未见P-选择素表达,糖尿病模型组肾小管上皮细胞明显表达P-选择素；与4w、8w相比,12w的糖尿病模型组肾小管间质中P-选择素的表达明显增强；且与DC的数量显著相关。(4)与糖尿病模型组相比较,同期阿托伐他汀治疗组肾小管间质DC、P-选择素表达的数量及密度均明显减弱,肾小管间质损害程度减轻。结论DKD时,肾组织中有明显的DC浸润,并且只分布于肾小管间质及血管周围,不存在于肾小球。肾组织浸润的DC数量与P-选择素蛋白的表达量相关,阿托伐他汀可不依赖其调脂作用,而通过减少肾组织中P-选择素的表达及DC的浸润发挥肾脏保护作用。第二部分树突状细胞在糖尿病鼠肾组织聚集机制研究目的探讨树突状细胞(DC)在糖尿病肾病(DKD)鼠肾小管间质浸润机制。方法将SPF级健康雄性昆明小鼠18只随机分为糖尿病模型组(D组,n=9),熊果酸组(T组,n=9只),另设9只小鼠为正常对照组(N组)。前两组小鼠采用链脲佐菌素(STZ)溶于枸橼酸缓冲液(0.1mmol/l, pH=4.2),禁食后按40mg/kg-d,连续5d腹腔注射制备糖尿病模型,第五次腹腔注射的72h后断尾采血测空腹血糖>16.7mmol/L为成功模型。造模成功后,熊果酸治疗组小鼠自成模之日起每日清晨予熊果酸40mg/kg配在饮用水中,灌胃一次；健康对照组和糖尿病模型组小鼠则每日予以等量饮用水灌胃。实验观察周期为8周,实验结束时称体重,检测24小时尿蛋白、血肌酐、血糖、肾重/体重等指标；肾组织行HE染色,光镜下观察肾脏病理改变；RT-PCR及Western blot观察肾组织中P-选择素mRNA和蛋白的表达；EMSA检测NF-κB DNA的活性；采用免疫荧光染色及荧光图象分析法观察CDllc+DC在各组小鼠肾组织中的分布变化。结果(1)与正常对照组相比较,糖尿病模型组小鼠的24小时尿蛋白、血肌酐、肾重/体重等指标均显著升高,HE染色可见肾组织中存在病理学损害；(2)正常对照组肾组织中未见CD11c+DC表达,糖尿病模型组肾小管、肾间质、肾血管中可见CD11c+DC表达,以肾间质表达最为显著,与肾小管间质病变程度明显相关；(3)与正常对照组相比较,糖尿病模型组肾小管上皮细胞高表达P-选择素,且与DC的数量显著相关；(4)与正常对照组相比较,糖尿病组肾组织NF-κB DNA的活性增高；(5)、熊果酸治疗组能明显抑制上述变化,降低肾小管间质浸润的DC的数量、NF-κB DNA的活性及P-选择素的表达,减轻肾小管间质损害程度,延缓肾功能的进展。结论DC可能通过NF-κB—P-选择素途径浸润DKD肾组织,熊果酸通过抑制NF-κB DNA的活性,减轻肾脏P-选择素的表达,从而抑制DKD肾组织中浸润的DC,发挥肾脏保护作用。第三部分高糖对小鼠骨髓源树突状细胞发育成熟的影响目的探讨高糖对小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)发育成熟的影响。方法小剂量rmGM-CSF(重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子,20ng/ml)和rmIL-4(重组小鼠白细胞介素-4,lOng/ml)联合体外诱导培养C57BL/6j小鼠骨髓来源的未成熟DC,第7天收集细胞,分别在含有5.5mmol/L D-葡萄糖、30mmol/LD-葡萄糖、30mmol/L D-葡萄糖+20μmol/L熊果酸的RPMI-1640完全培养基中培养。实验中倒置显微镜观察细胞的形态学变化,实验结束时流式细胞仪检测细胞表面标志分子的表达水平。结果(1)、体外培养的DC经倒置显微镜观察发现：5.5mmol/L D-葡萄糖培养的未成熟DC多为圆形,毛刺状突起较少,而30mmol/L D-葡萄糖刺激后的DC半悬浮生长,表面较多树枝样突起,形态各异,表现为成熟DC形态；(2)、流式细胞仪检测发现于与未成熟DC比较,高糖刺激后成熟DC中CD11c+CD80、MHCⅡ+CD86+的阳性率分别高达94.58%、89.96%,熊果酸干预高糖刺激的DC中CD11c+CD80、MHCⅡ+CD86+的阳性率分别是60.63%、40.94%。结论高糖能够促进DC成熟,熊果酸可以明显抑制这一作用。