论文部分内容阅读
白念珠菌是一种人类常见的机会型致病真菌,常导致免疫系统受损的人群粘膜表面感染或系统感染。决定白念珠菌致病性的一个重要因素是其与宿主细胞或组织的粘附能力,而这种能力与白念珠菌细胞表面的粘附因子相关。
本研究通过功能互补的方法,从白念珠菌基因组文库中筛选到一个能够互补酿酒酵母floll和flo8缺失株功能缺陷的克隆。该克隆所含基因的编码产物具有细胞壁粘附因子的基本特征:N末端具有信号肽序列,C末端具有GPI锚定位点,中部含有多个由丝氨酸和苏氨酸组成的串联重复序列。进一步的序列分析发现该基因与编码粘附因子Eapl的基因是等位基因,只是具有更多更长的中间串连重复序列。因此我们将筛到的长等位基因命名为EAPl-L(EAPl-Long),报道的短等位基因更名为EAPl-S(EAPl-Short)。EAPl-L和EAPl-S都能互补酿酒酵母粘附因子floll缺失株的侵入生长和假菌丝形成缺陷,但EAPl-L具有更强的表型。在白念珠菌中敲除EAPl-L和EAPl-S,缺失株对干扰细胞壁合成的化学试剂刚果红敏感。Northern检测发现EAPl-L和EAPl-S的转录受不同的转录调控因子调控,正调控因子Efgl,Tec1或Crk1的缺失下调EAPl-S的表达却不影响EAPl-L的表达而负调控因子Tupl,Nrgl的缺失上调EAPl-S的表达却不影响EAPl-S的表达。过表达正调控因子Cphl能够同时强烈激活EAPl-S和EAPl-S的表达,且该菌株能够发生明显的絮凝反应,而Cphl过表达的eapl-l/eapl-S缺失株却没有明显的絮凝反应,这一结果表明Eapl-L和Eapl-S参与白念珠菌细胞之间的粘附。
白念珠菌的形态转换能力也是其致病性最重要的决定因素之一,这种形态变化受各种外界刺激和细胞内信号转导途径的调控。白念珠菌CaMSSll基因编码一个637个氨基酸的蛋白,它在酿酒酵母中的同源物是丝状生长的转录激活因子。在白念珠菌中敲除CaklSSll部分阻断白念珠菌的菌丝生长,而高表达CakMSSll基因则激活菌丝的生长。在小鼠系统感染实验中,CaMSSll基因缺失株的毒性明显降低。这些结果表明CaMssll正向调控白念珠菌的丝状生长同时也影响该致病菌的毒性表现。从结构分析CaMssll具有一个能够形成稳定二聚体结构的LisHmotif结构域,免疫共沉淀实验表明,CaMssll能够和另一个具有LisH motif的转录因子CaFlo8存在相互作用,二者可能一起调控菌丝的发育过程。白念珠菌CaSFLl基因编码一个805个氨基酸的蛋白,在酿酒酵母中表达能够校正它的同源物sfll缺失株的絮凝反应和强菌丝生长的表型。CaSFLl的缺失能够增强白念珠菌的菌丝发育,Northern结果显示菌丝特异性基因HWPl和ECEl在casfll缺失株中去抑制表达。此外,高表达CaSFLl在菌丝诱导条件下抑制菌丝的形成。这些结果表明CaSfll是一个新的调控白念珠菌菌丝形成的抑制因子。小鼠系统感染实验中CaSFLl的缺失和高表达都降低了菌株的毒性,说明CaSfll的表达量影响白念珠菌的毒性。CaF108是白念珠菌菌丝发育和毒性表现的一个关键蛋白。为了阐明CaSfl1与CaF108的遗传关系,我们构建了casfll caf108双基因缺失株,该双缺失株完全阻断了白念珠菌的菌丝发育而在casfll缺失株中高表达CaFL08则加强菌丝的生成,说明CaSfll的抑制作用可能通过拮抗CaF108的功能来实现。在微氧包埋条件下,CaSfll具有双重功能,在CaF108存在时抑制菌丝发育,casfll缺失株形成比野生型更多的菌丝。而在CaF108缺失情况下,在37℃,CaSfll呈抑制作用,在25℃呈激活作用。CaF108蛋白的存在可能阻止CaSfll和靶基因启动子结合,进而阻止CaSfll的抑制作用以及激活作用。这些结果表明CaSfll和CaF108存在一种相互拮抗的关系共同调节白念珠菌的形态发生。