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犏牛是牦牛与普通牛种的远缘杂交后代,相较于双亲对高海拔缺氧等恶劣的自然环境表现出更强的适应能力和更高的生产使役性能。由于种间杂交,生殖隔离在犏牛上表现为F1代雄性不育,无法将亲本的优良性状进行传承,从而大大制约了牦牛的遗传改良和优良品种的培育。针对犏牛雄性不育,国内外学者进行了大量的研究证实犏牛雄性不育的最主要原因是精子发生阻滞,但具体机制尚不完全清楚。本研究拟通过高通量测序技术分析比较牦牛和犏牛睾丸转录组,以探究犏牛在精子发生过程中的调控差异,以期从分子水平上对犏牛精子发生阻滞机制进行较全面系统的研究,为犏牛雄性不育的研究提供理论依据。本试验以牦牛和犏牛睾丸组织学观察为基础,结合转录组测序技术(RNA-seq)对牦牛和犏牛睾丸实质组织进行转录组测序,生物信息学分析牦牛与犏牛精子发生过程中的差异表达基因和可变剪切,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异表达基因在睾丸中的表达,主要研究结果如下:1.犏牛及牦牛睾丸组织学观察显示:犏牛睾丸结构完整,形态大小无异常;与牦牛相比,犏牛睾丸曲细精管形态各异,管壁皱缩,间质增宽;犏牛睾丸中主要生殖细胞为贴于曲细精管基膜的单层精原细胞,而精母细胞及精子细胞则极少出现;牦牛睾丸曲细精管中从基膜至管腔分布有不同发育阶段的生殖细胞,呈多层排列。2.通过RNA-Seq成功构建了牦牛和犏牛睾丸组织的转录组谱,共获得29.5Gb的高质量数据,经过严格的差异基因筛选,共得到2960个差异表达基因,其中679个基因相对于牦牛表达上调,2281个基因表达下调。3.差异表达基因的GO富集分析:GO显著富集条目中包含了大量与精子发生相关的基因。STRA8和NLRP14的上调可能导致原始生殖细胞或未分化精原细胞积累,生殖细胞凋亡加剧。SPP1,SPIN2B,PIWIL1与细胞周期进程和精原细胞基因组的完整性相关,表明精子发生阻滞开始于精原细胞分化阶段;CDKN2C,CYP26A1,OVOL1,GGN,MAK,INSL6,RNF212,TSSK1B,TSSK2和TSSK6 与减数分裂相关,这些基因的下调使减数分裂过程中精子发生阻滞加剧;PRM2、ODF3等与精子结构组分相关的基因表达下调,导致精子形态异常,结构缺陷从而缺乏受精能力。4.差异表达基因的PATHWAY富集分析:Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长、分化的关键信号途径。通路中Wnt3a,PP2A和TCF/LEF-1等基因的下调阻滞了犏牛精原干细胞的分化。5.可变剪切分析:以普通牛基因组为参考背景,使用TOPHAT比对软件对转录组序列进行比对发现,犏牛中的可变剪切事件明显低于牦牛,推测可能由于低的可变剪切,使犏牛的蛋白质多样性低下,从而犏牛表现为雄性不育。6.RNA-Seq可靠性检测:按照不同差异倍数挑选10个差异基因进行荧光定量(Q-PCR)验证,结果表明无论是高通量的转录组测序水平,还是低通量的Q-PCR水平,都呈现出一致结果。说明本试验采用的RNA-Seq方法所获得的结果真实可靠。通过对组织学比较和转录组相关分析显示,精子发生阻滞开始于精原细胞分化阶段,在减数分裂阶段加强,后期精子形态和结构异常,从而造成了犏牛受精能力的缺乏。从可变剪切分析中推测犏牛由于蛋白质多样性的低下故犏牛犏牛表现为雄性不育。本研究从组织学和转录组学方面阐明犏牛雄性不育的机制,为研究犏牛不育提供了一定的参考依据。