论文部分内容阅读
肿瘤治疗效果不佳是当前临床研究的一大难题。目前临床上常用放化疗、手术切除、肝移植、介入等手段进行肿瘤的治疗,但单一的治疗方式难以延长患者的生存时间,多手段协同治疗是目前乃至未来很长时间的研究重点和发展趋势。纳米生物技术结合化学、生物学、材料学、医学等多学科技术于一体,在临床肿瘤治疗方面有着不可估量的发展潜力。近年来依托纳米生物技术,开发以纳米材料为载体的纳米载药复合体系,联合一种或多种肿瘤治疗手段的策略,在生物医学界受到了高度重视。本论文旨在构建以氧化石墨烯为生物纳米载体的载药纳米复合系统,并运用体内外实验对该系统的肝癌靶向性能和化疗联合光热治疗的肿瘤抑制效果进行验证,为开发治疗肝细胞癌的靶向性药物奠定基础。在本次研究中,我们先采用经典的方法制备了氧化石墨烯（GO）片层纳米材料,通过透射电子显微镜（TEM）和原子力电子显微镜（AFM）的表征,显示所制备的氧化石墨烯具备标准的形貌和合适的尺寸。然后,我们利用酰胺反应的原理对氧化石墨烯进行修饰,先修饰氨基化聚乙二醇（NH2-PEG-NH2）,再修饰乳糖酸（LA）,其中乳糖酸是肝细胞特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的靶向分子。以上修饰通过紫外可见分光光度计、傅里叶红外光谱仪、马尔文粒度分析仪验证确认。最后,通过?-?堆积装载疏水药物姜黄素（CUR）,获得氧化石墨烯载药纳米复合体（GO-PEG/LA-CUR）,经检测该复合体的水合粒径为257.5±4.5 nm,zeta电势为-29.8±1.19 mv,载药率为56.82±1.38%,包封率为56.34±2.05%。接下来,我们主要开展了以下三方面的相关研究工作:（1）药物释放和光热性能的研究:在有无近红外辐照（NIR）条件下,分别将GO-PEG/LA-CUR置于不同pH的缓冲液中,进行体外药物释放研究。结果显示,在中性（pH 7.4）和弱酸性（pH 5.6）缓冲液中,72小时后的药物释放分别为27%和68%;进行近红外辐照后,72小时的药物释放显著提高,分别可达到39%和95%,说明该复合体在酸性条件和近红外辐照条件下具有较好的药物释放能力。通过光热实验,我们发现在近红外光辐照5 min的条件下,载药复合体GO-PEG/LA-CUR溶液的温度变化与溶液的浓度以及近红外照射强度正相关,其中50?g/m L的载药复合体溶液在1.5 W/cm2辐照5 min后温度增高约8℃,展现了良好的光热转换性能。（2）体外靶向性和疗效的研究:以人肝癌细胞系HepG2和Huh7为实验组细胞,人正常肝细胞L02和人胚肾细胞HEK293T为对照组细胞,利用流式细胞技术和激光共聚焦技术对载药纳米复合体的靶向递送性能进行验证。实验结果显示,GO-PEG/LA-CUR在实验组肝癌细胞系中的荧光强度明显强于对照组;并且通过半乳糖竞争性抑制ASGPR后,肝癌细胞系中的荧光强度显著减弱。结果说明,GO-PEG/LA-CUR具有通过ASGPR介导的特异性靶向肝癌细胞系的性能。另外,体外治疗实验中,单纯热疗组、含药浓度为30?mol/L的GO-PEG/LA-CUR组、含药浓度为30?mol/L的GO-PEG/LA-CUR外加进行近红外辐照5 min组,肝癌细胞活力依次分别约为80%、55%、40%。结果说明,与单纯的光热治疗或化学治疗相比,协同化学光热治疗展现出了显著的细胞急性毒性作用,可更好的抑制肝癌细胞的生存。（3）体内分布和疗效的研究:我们在非靶向载体（GO-PEG）和靶向载体（GO-PEG/LA）表面修饰荧光染料罗丹明B（RhB）,利用小动物活体成像仪,对纳米载体在皮下移植瘤小鼠体内的分布情况进行了荧光成像示踪。结果发现在注射靶向纳米载体后,肝脏、肿瘤、肾脏部位相继出现荧光信号,其中肿瘤部位的荧光强度在注射12h时达到最强,在24 h时依然可见,说明纳米载体在动物体内具有靶向运输至肝肿瘤部位并滞留的性能。此外,我们通过为期14天的皮下移植瘤小鼠的治疗实验,评价纳米载药复合体的体内整合疗效。结果显示协同化学光热治疗组小鼠的肿瘤生长最为缓慢,呈现所有治疗组中最高的肿瘤抑制率——86.2%,说明GO-PEG/LA-CUR可以用于肝癌协同化学光热治疗。本研究提出的氧化石墨烯纳米复合系统保持了氧化石墨烯优异的光热性能,药物释放呈现酸响应和光热响应,在体内外均具有良好的肝癌细胞靶向递送能力。此外,该氧化石墨烯纳米复合系统能够将化学治疗和光热治疗这两种手段协同作用于肝癌,治疗水平剂量在体内外均未造成明显的生物毒副作用,实现了精准治疗与联合治疗肝癌的目的,显著提高了治疗效果。因此,本课题的研究有望为今后肝癌靶向性给药系统的构建及肝癌联合治疗提供有意义的借鉴。