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肝纤维化是肝细胞坏死或损伤后常见的慢性进行性肝病。慢性肝炎中绝大多数都有肝纤维化,肝纤维化中 25%-40%最终发展为肝硬化乃至肝癌。当前我国存在大量慢性肝炎患者,都有不同程度的肝纤维化,若能找出一种服用方便,价廉,高效的抗肝纤维化药物必将造福人民。 甘参复方是由丹参与甘草组成的益气、和血、柔肝方剂,以丹酚酸与甘草酸作为指标性有效组分。丹酚酸是丹参有效成分中重要的水溶性物质,甘草酸是甘草中重要的化学成分,这两味中药均具有较好的抗肝纤维化作用。丹酚酸与甘草酸抗肝纤维化作用环节不同,经临床验证,两药联用抗肝纤维化效果好于甘参复方中任一组分的单用。 采用经典的CCl4致大鼠肝纤维化模型,选择丹酚酸与甘草酸可能作用于肝纤维化的关键环节进行研究,找出了这两种组分在多环节阻抑肝纤维化病理过程的效应特征及配伍机理。 实验采用清洁级SD雄性大鼠 100 只,除正常组大鼠注射等量橄榄油外,造模各组大鼠皮下注射 40% CCl4橄榄油剂 3ml/kg,每周 2 次,在造摸开始后第二周开始灌胃给药(正常组与模型组给蒸馏水),共 10 周。 取材,称量大鼠肝重,并计算肝脏系数,检测血浆肝脏功能(生化指标)、放免检测血浆透明质酸、碱水解法检测肝组织羟脯氨酸含量,ELISA法检测肝组织匀浆Ⅳ型胶原(Col_Ⅳ)、层粘蛋白(LN)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13),肝组织石蜡切片HE染色、Masson染色、血小板衍生生长因子(PDGF)免疫组化显色、转化生长因子β1(TGFβ1)免疫组化显色。 实验结果显示: 1. 甘参复方总体疗效优于方中任一组分的单用 甘草酸与合方在防治体重降低方面效果较为突出。造模各组大鼠从第 2 周开始到实验结束体重增长明显慢于正常组(P<0.01 或 0.05),说明造模刺激对大鼠体重增长影响很大;其中造模初期对合方组大鼠体重增长影响最大,在造模第 2 周合方组大鼠体重最轻,与其体重差异显著的组数最多(P<0.01 或 0.05),造模第 3、4、5 周体重增长较快,与其体重差异显著的组数逐渐减少,到後来体重超过秋水仙碱组与丹酚酸组,模型组体重高于合方组可能与其后期腹水形成有关。在降低肝脏系数方面,合方疗效最佳(P<0.05),丹酚酸也有一定的疗效,甘草酸疗效较差。在降低血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)方面,丹酚酸疗效最佳(P<0.01),合方次之(P<0.01),甘草酸也具有较好的疗效(P<0.05)。在降低血浆门冬氨酸氨基转移酶(AST)方面,甘草酸最优(P<0.01),合方次之(P<0.05),丹酚酸疗效稍差。在降低总胆红素(TBil)方面,丹酚酸疗效最佳(P<0.05),甘草酸与合方疗效不明显。在升高总蛋白(TP)与白蛋白与球蛋白比值(A/G)方面,各组无差异。在升高血浆白蛋白(ALB)方面,甘草酸与合方疗效最佳,丹酚酸次之。在降低透明质酸方面,各药均有不错的疗效,以合方组最优(P<0.01)。甘参复方各组在降低肝组织匀浆羟脯氨酸(Hyp)方面疗效不理想,不及秋水仙碱(P<0.05)。在降低胶原面积方面合方组疗效最佳(P<0.01),甘草酸疗效次之(P<0.05),丹酚酸亦有较好的疗效(P<0.05)。 2. 组织病理学改变: 光学显微镜下观察 HE/Masson 染色切片标本,充分显示了各组大鼠肝脏的组织学病变特征: 正常组:可见正常组大鼠肝组织无异常表现。肝脏正常结构:肝脏被膜为薄层结缔组织;实质由肝小叶和门管区组成。肝小叶呈多角棱柱体,其中心为中央静脉,其周围为放射状排? 2 ? 甘参复方抗肝纤维化配伍原理研究列的肝细胞索;肝小叶边缘为肝小叶界板,是连续、封闭的一层肝细胞;肝细胞索间或与肝细胞界板间相互吻合成网状。肝细胞条索之间为肝血窦,其内皮细胞分布规则,可找到库普弗细胞(Kupffer)细胞。肝细胞索与肝血窦之比约为 5:2。肝细胞为多边形细胞,胞质嗜酸性染色教明显;核圆形,染色质稀疏且沿核膜分布,可见核仁。门管区主要为结缔组织,含有小叶间动脉、静脉和胆管,可有一定量的淋巴细胞、浆细胞分布。偶尔在肝小叶内可出现累及 1-2 个肝细胞范围的肝细胞坏死及该处的淋巴细胞、浆细胞浸润(点状坏死)。Masson染色显示肝门管区出现少量蓝色胶原纤维。模型组:HE 染色可见肝小叶正常结构消失,增生的胶原纤维条索相互连接,完全分隔正常的肝小叶形成肝硬化;此时,形成了许多类圆形的肝细胞团为假小叶;其肝细胞索排列紊乱而不呈放射状,中央静脉异位(偏位、不出现或出现几个),肝细胞团内出现门管区结构;肝索与肝窦的比例约为 8:1;假小叶内的肝细胞出现大量的颗粒样变性、胞质疏松化和细胞水肿,部分肝细胞可区分为脂肪空泡,散在灶性肝细胞溶解坏死,仍有被胶原纤维间隔再分隔的趋势;可出现毛细胆管内瘀胆及胆栓形成。在假小叶之间的纤维间隔连续、厚薄不均,胆管增生不明显,可有较多的淋巴细胞、单核细胞浸润,原有门管区明显增宽、增粗,有明显的纤维束形成,较粗而密,相邻的门管区或中央静脉之间已形成明显的纤维间隔,分隔包绕肝组织,无充血、无水肿、无肝细胞增生。肝窦狭窄、扭曲。Masson 染色显示纤维间隔内有大量胶原沉积。秋水仙碱组:肝索与肝窦的比例约为 6:1;部分大鼠增生的胶原纤维条索未相互连接,未能完全分隔肝小叶为肝纤维化;部分大鼠增生的胶原纤维条索相互连接而完全分隔正常的肝小叶为肝硬化。丹酚酸组:病变特征与模