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研究背景糖尿病(diabetic mellitus,DM)是当今世界最广泛的慢性代谢性疾病之一。据估计,到2045年,全球将有6.93亿糖尿病患者,这将会给社会、经济和卫生系统造成沉重负担。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是糖尿病的重要特征,而慢性低度炎症则是IR的主要原因。作为炎症反应的起始部位——脂肪组织在IR中的作用不容被忽视。然而,脂肪组织炎症的潜在机制仍不清楚。巨噬细胞作为脂肪组织炎症的主要调控细胞在其中发挥重要作用。巨噬细胞胞外陷阱(macrophage extracellulartraps,METs)的形成可能有助于脂肪组织炎症的发展。细胞外陷阱(extracellulartraps,ETs)是由DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成的特殊网络结构,具有杀死病原体和无菌性炎症的重要作用。ETs可以直接刺激脂肪细胞释放炎性细胞因子。据报道,在2型糖尿病患者的脂肪组织中存在ETs形成,在肥胖的小鼠脂肪组织中,巨噬细胞也会产生此类ETs。但是,METs的形成机制尚需进一步阐明。氧化应激是促进METs形成的重要因素。研究证实,METs是通过活性过程释放的,并取决于氧化爆发。铁代谢紊乱(例如铁沉积)是氧化应激的重要原因。而脂肪组织中的铁代谢紊乱也是糖尿病的重要特征。铁调素(hepcidin,Hep)是机体内最重要的铁代谢调控激素之一,可以抑制铁在细胞中的流出,当在一些疾病情况下造成的铁分布异常会引起局部铁沉积,进而导致一系列病理生理问题。肝脏是Hep的主要合成器官,但脂肪组织、巨噬细胞也是表达Hep的重要部位。据报道,在糖尿病条件下,Hep在脂肪组织中的表达增加和铁沉积会导致巨噬细胞聚集并释放炎性细胞因子。但是,Hep所导致的炎性因子的释放是否与METs产生有关仍缺乏相关研究。综上所述,Hep可能在2型糖尿病状态下的脂肪组织炎症和胰岛素抵抗的调节中扮演重要角色并影响脂肪组织METs生成。为了对其潜在机制做进一步的深入研究,我们提出如下假说:糖尿病状态下Hep表达升高,METs的生成增加并促进脂肪组织的炎症和胰岛素抵抗。鉴于以上假说,我们以db/db小鼠为研究对象,运用基因沉默的方法探究Hep对METs形成和脂肪组织炎症因子表达的影响;并在体外以巨噬细胞为对象进一步探究铁调素对炎症的作用机制。研究目的1.探究Hep基因沉默对脂肪组织METs生成的影响;2.探究Hep基因沉默改善脂肪组织炎症和胰岛素抵抗的途径及作用机制;3.探究Hep基因沉默改善体外巨噬细胞METs生成和炎症的途径和机制。材料与方法1.7周龄雄性db/db小鼠21只,雄性WT小鼠7只。适应3周后,将db/db小鼠随机分为糖尿病组,糖尿病空载体组和糖尿病Hep基因沉默组。10周龄时,糖尿病Hep基因沉默组的小鼠注射Hep-shRNA的腺相关病毒rAAV9,糖尿病空载体组的小鼠注射等量的空病毒,糖尿病组小鼠注射等量的生理盐水。以野生型小鼠作为对照组。16周后对小鼠进行取材,收集血清和主要器官的标本并称重。2.实验末检测各组小鼠各项生化指标:甘油三酯(triglycerides,TG)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)及空腹胰岛素(fasting insulin,FINS),计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)。3.RT-PCR、Western blot及免疫组织化学等方法检测脂肪组织铁代谢情况及相关蛋白Hep、H-Ferritin和L-Ferritin的表达水平。4.HE染色观察脂肪组织形态。5.免疫组织化学检测脂肪组织中巨噬细胞浸润情况。6.免疫荧光检测脂肪组织METs生成水平。7.RT-PCR和免疫组织化学检测脂肪组织炎症因子TNF-α和IL-1β的水平。8.超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)检测试剂盒检测脂肪组织SOD及GSH-Px水平9.Western blot检测脂肪组织IRS-1/AKT/GSK3β信号通路蛋白磷酸化表达水平。10.Hep-siRNA转染巨噬细胞,检测体外巨噬细胞铁代谢。11.ROS检测试剂盒检测体外巨噬细胞氧化应激水平。12.免疫荧光技术检测体外巨噬细胞METs生成情况。13.RT-PCR和Elisa检测体外巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1β的水平。结果1.与对照组小鼠相比,糖尿病小鼠TG、FBG、FINS、ISI明显升高;而三组糖尿病小鼠则无统计学差异。2.与对照组小鼠相比,糖尿病小鼠体重、脂肪组织重量、肝脏重量和肾脏重量明显升高;三组小鼠的体重、肝脏重量和肾脏重量等指标无明显统计学差异;而与糖尿病空载体组相比,糖尿病Hep基因沉默组小鼠脂肪组织重量有所下降,存在统计学差异。3.与对照组小鼠相比,糖尿病小鼠脂肪组织铁沉积增加,Hep、H-铁蛋白与L-铁蛋白水平明显升高;与糖尿病空载体组小鼠相比,糖尿病Hep基因沉默组小鼠脂肪组织中铁沉积减少,Hep、H-铁蛋白与L-铁蛋白的表达水平显著降低。4.脂肪组织HE染色表明,糖尿病小鼠脂肪细胞排列紊乱,面积较大;而糖尿病Hep基因沉默组小鼠脂肪细胞排列较为规整。5.与对照组相比,各糖尿病组小鼠脂肪组织巨噬细胞浸润显著增多;与糖尿病空载体组相比,糖尿病Hep基因沉默组小鼠脂肪组织巨噬细胞浸润明显下降。6.与对照组小鼠相比,糖尿病小鼠脂肪组织METs生成显著增多;与糖尿病空载体组小鼠相比,糖尿病Hep基因沉默组小鼠脂肪组织METs生成显著减少。7.与对照组小鼠相比,糖尿病小鼠脂肪组织炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平明显升高;而与糖尿病空载体组小鼠相比,糖尿病Hep基因沉默组小鼠脂肪组织中炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平降低。8.与对照组小鼠相比,糖尿病小鼠脂肪组织SOD与GSH-Px的活性降低;而与糖尿病空载体组小鼠相比,糖尿病Hep基因沉默组小鼠脂肪组织SOD与GSH-Px的活性显著升高。9.与对照组小鼠相比,糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素信号通路蛋白磷酸化水平显著降低;而与糖尿病空载体组小鼠相比,糖尿病Hep基因沉默组小鼠脂肪组织胰岛素信号通路蛋白磷酸化水平显著升高。10.与对照组相比,LPS刺激组的巨噬细胞铁调素表达水平和铁沉积显著增高;Hep-siRNA干预组巨噬细胞LPS刺激后铁调素表达水平和铁沉积都有所改善。11.与对照组相比,LPS刺激组的巨噬细胞ROS生成水平显著增高;Hep-siRNA干预组巨噬细胞LPS刺激后ROS生成水平降低。12.与对照组相比,LPS刺激组的巨噬细胞METs生成水平显著上升;Hep-siRNA干预组巨噬细胞LPS刺激后METs生成水平降低。13.与对照组相比,LPS刺激组的巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平显著上升;Hep-siRNA干预组巨噬细胞LPS刺激后炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平明显下调。结论1.Hep基因沉默通过减轻氧化应激来抑制METs生成并减轻脂肪组织炎症。2.Hep基因沉默通过改善铁沉积、炎症和IRS-1/AKT/GSK3β信号通路来减轻脂肪组织胰岛素抵抗。3.Hep基因沉默通过降低铁沉积、ROS及METs生成等途径改善体外诱导的巨噬细胞炎症。