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目的:建立红活麻香豆素的含量测定方法;筛选制备总香豆素有效部位的最佳工艺;通过体外细胞实验和体内研究,探讨红活麻总香豆素的免疫抑制作用。 方法:(1)以滨蒿内酯为对照品,采用紫外分光光度法(UV),于340nm波长处测定吸光度,对精密度、稳定性、重复性以及加样回收率进行考察,建立红活麻总香豆素的含量测定方法。 (2)以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数四个因素为考察对象,每个因素分别设3个水平,进行L9(34)正交试验,以总香豆素的提取率作为评价指标,优选最佳醇提工艺;取3种备选树脂,进行静态吸附试验,筛选出最佳树脂;通过考察最佳树脂对红活麻总香豆素的吸附性能和洗脱参数,主要包括:上样浓度、径高比、最大上样量、水洗体积用量、洗脱液醇浓度以及洗脱剂用量,以筛选出最佳纯化工艺。(3)体外培养BALB/c小鼠T、B淋巴细胞,四唑盐比色法(MTT)检测红活麻总香豆素对其增殖反应的影响;建立体内卵清白蛋白(OVA)诱导的BALB/c小鼠免疫功能增强模型,将小鼠分为模型对照组,空白对照组,红活麻总香豆素高、中、低剂量组,于免疫当天开始给药,每日给药一次,连续4周。给药结束后,处死小鼠,测定免疫器官/体重比值,观察对脾淋巴细胞增殖实验的影响。BALB/c小鼠给药4周,通过迟发型变态反应(DTH)以及溶血空斑形成数量,观察红活麻总香豆素对免疫系统的作用。 结果:(1)滨蒿内酯对照品在0.004～0.012mg/mL浓度范围内与吸光度线性关系良好,精密度RSD值为0.11％,稳定性RSD值为0.3％和0.41％,重复性RSD值为1.51％,平均回收率为99.38％,RSD值为1.8％。 (2)最佳提取工艺:红活麻粗粉浸渍于70％乙醇中提取3次,每次1.5h,溶媒用量为4倍。最佳纯化工艺:选用HPD300大孔吸附树脂,以树脂径高比为1:7,上样液浓度为0.4g生药·mL-1上样,药材和树脂的用量比为4:1。上样之后,用4倍柱体积(BV)的蒸馏水除去杂质,再用4BV的70％乙醇作为洗脱剂进行洗脱。收集70％乙醇洗脱液,挥干溶剂即得红活麻总香豆素有效部位。 (3)红活麻总香豆素高、中、低浓度组对体外培养的T、B淋巴细胞增殖均有一定的抑制作用,中浓度对T淋巴细胞增殖的抑制作用最为明显,而低浓度对B淋巴细胞增殖的抑制作用最好;体内实验中,给药组小鼠免疫脏器指数与模型组相近,差异无统计学意义;高、中、低剂量均可以抑制ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖反应,与模型组相比,差异均有统计学意义(P<0.01),中剂量的抑制作用强于高、低剂量;高、中、低剂量均可以降低BALB/c小鼠DTH反应的足跖肿胀度,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);抗体生成实验表明,高、中剂量组的溶血空斑数与对照组相比,均减少,且差异具有显著性(P<0.01),而低剂量组与对照组相比,溶血空斑数虽有所减少,但差异无统计学意义。 结论:(1)本研究建立的紫外分光光度法测定红活麻香豆素的含量测定方法准确、稳定、重复性好。 (2)实验结果表明,HPD300大孔吸附树脂提取纯化红活麻总香豆素的工艺稳定可靠,有效部位中香豆素的含量达到52％以上。 (3)红活麻总香豆素在体内体外均对细胞免疫和体液免疫具有一定的抑制作用,可作为免疫抑制剂。